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Alternative approaches for the treatment of adenovirus infections

Mirza Ibrisimovic

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Angela Witte

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30149.33783.658354-8

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Adenovirale Infektionen von immunsupprimierten Patienten stellen ein großes klinisches Problem dar, und sind eine häufige Ursache für tödliche Folgen nach allogenen Stammzelltransplantationen. Da Behandlungsmöglichkeiten gegen adenovirale Infektionen immer noch nicht ausreichend verfügbar sind, besteht der dringende Bedarf an alternativen Behandlungsstrategien. Im ersten Teil der hier vorgestellten Studien war ich in ein Projekt eingebunden, das untersuchte ob die selektive Expression des Herpes simplex Virus Thymidinkinasegens (HSV-TK) in Adenovirus-infizierten Zellen, diese für eine Behandlung mit dem Pro-Pharmakon Ganciclovir (GCV) empfänglich macht. GCV wird nur durch HSV-TK in seine aktive Form umgewandelt. Eine Expression von HSV-TK ausschließlich in Adenovirus-Wildtyp-infizierten Zellen wurde erreicht, indem dieses Gen unter die Kontrolle des Adenovirus 5 (Ad5) E4 Promotors gebracht wurde. Dieser Promotor wird nur aktiv, wenn das adenovirale Protein E1A vorhanden ist. Um hohe Transduktionsraten und gezielten Transfer in für adenovirale Infektionen typische Zellen zu garantieren, wurde die gesamte Expressionskassette in einen replikationsdefizienten, adenoviralen Vektor transferiert, dem das E1A Gen fehlt. Wir konnten zeigen, dass die Hintergrundexpression durch den E4-Promotor niedrig genug war, um Zytotoxizität in der Gegenwart von niedrigen, therapeutisch relevanten, GCV-Konzentrationen in Zellen, die nicht mit Ad5 infiziert waren, zu verhindern. Dennoch war die Expression in Adenovirus-infizierten Zellen um das 7-fache erhöht, und eine Behandlung mit geringen Mengen GCV konnte die Ad5 DNA Replikation effizient inhibieren. Die Genomkopiezahlen und die Produktion von infektiösen Viruspartikeln konnten um bis zu 99% reduziert werden. Weiters führte dies zu einer Erhöhung der Zellviabilität. In Zuge eines anderen Projekts untersuchte ich das Potential von RNA Interferenz (RNAi), zur Inhibierung von Adenoviren. Ich konnten zeigen, dass siRNAs, die die adenoviralen Transkripte für E1A, das preterminale Protein (pTP), die DNA Polymerase, IVa2, Hexon und Protease degradieren, Adenoviren in vitro hemmen können. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass artifizielle miRNAs (amiRNAs), die von einem replikationsdefizieten adenoviral Vektor exprimiert werden, die adenovirale Replikation inhibieren können. Da der HSV-TK Ansatz auf das Blockieren der DNA Replikation limitiert ist, habe ich auch untersucht, ob gleichzeitiges Stilllegen von adenoviralen Genen, die an der Replikation beteiligt sind, zu einem additiven, inhibitorischen Effekt führt. Die gegen pTP gerichtete, amiRNA, deren Expression unter der Kontrolle eines Tetrazyklin-regulierten CMV Promotors stand, wurde in einen replikationsdefizienten adenoviralen Vektor transferiert, der gleichzeitig die Expression des HSV-TK Gens ermöglichte, das unter der Kontrolle des adenoviralen E4 Promotors stand. Ich konnte zeigen, dass das Zusammenführen der zwei Ansätze, HSV-TK/GCV und RNAi, die Effizienz der Adenovirus-Inhibierung noch weiter steigern kann. Da die Zahl an Transplantationspatienten ständig ansteigt und damit verbunden auch vermehrt lebensbedrohliche Adenovirusinfektionen auftreten, können die vorliegenden Daten dazu beitragen, alternative Strategien zu entwickeln, um adenovirale Infektionen erfolgreich zu behandeln.

Abstract

(Englisch)

Adenovirus infections in immunocompromised patients constitute a clinical problem and a frequent cause of fatal outcomes in allogeneic stem cell transplantation. Treatment options for adenovirus infections are still unsatisfactory and alternative treatment strategies are highly needed. In the first part of presented studies, I investigated if delivery of the herpes simplex virus-encoded thymidine kinase gene (HSV-TK) into and selective expression within adenovirus-infected cells can render such cells amenable to anti-adenoviral treatment with the prodrug ganciclovir (GCV). GCV is exclusively converted into its active form by HSV-TK. Restriction of HSV-TK expression to wild-type (wt) adenovirus infected cells was achieved by transcription of the gene from the adenovirus 5 (Ad5) E4 promoter whose full activity is dependent on the presence of the adenoviral E1A protein. In order to guarantee high transduction rates and targeted delivery into typical adenoviral host cells, the entire expression cassette was transferred into a replication-deficient adenoviral vector lacking the E1A gene. I was able to show that E4 promoter-mediated HSV-TK background expression was sufficiently low to prevent cytotoxicity in the presence of low and therapeutically relevant GCV concentrations in cells not infected with wt Ad5. However, expression was several-fold increased in wt Ad5-infected cells and treatment with low levels of GCV efficiently inhibited wt Ad5 DNA replication. Genome copy numbers and output of infectious particles were reduced by up to >99.99% and cell viability was greatly increased. In a separate project I was involved in the investigation of the potential of RNA interference (RNAi) for the inhibition of adenoviruses. I was able to demonstrate that siRNAs designed to silence the adenoviral genes coding for the E1A, preterminal protein (pTP), the DNA polymerase, IVa2, hexon and the protease gene are capable of inhibiting adenoviruses in vitro. Furthermore, I was also able to prove that artificial microRNAs (amiRNAs), expressed from replication-deficient adenoviral vectors are able to inhibit adenovirus replication. Both, HSV-TK/GCV and miRNAs influence the adenoviral DNA replication. I have also investigated, if additional silencing of adenoviral genes involved in the replication of the viral genome leads to additive inhibitory effects. The amiRNA targeting pTP, whose expression was controlled from a tetracycline-regulated CMV promoter, was incorporated into a replication-deficient adenoviral vector which additionally allows for the simultaneous expression of the HSV-TK gene from the adenoviral E4 promoter. I was able to show that the integration of the two conceptual approaches, HSV-TK/GCV and RNAi, further increased the efficacy in adenovirus inhibition. In view of constantly rising numbers of transplant recipients and consequently increasing numbers of life-threatening adenovirus infections the findings are expected to aid in the development of alternative strategies to combat adenovirus infections.

Autor*innen

Mirza Ibrisimovic

Haupttitel (Englisch)

Alternative approaches for the treatment of adenovirus infections

Paralleltitel (Deutsch)

Alternative Behandlungsmethoden für Adenovirusinfektionen

Paralleltitel (Englisch)

Alternative approaches for the treatment of adenovirus infections

Publikationsjahr

2012

Umfangsangabe

170 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Joachim Seipelt ,

Maria Benkö

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC10846025

Utheses ID

22126

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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Schlagwörter