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The quantification of non-transferrin-bound iron
Robert Zika
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Christian Noe
DOI
10.25365/thesis.24834
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29126.31590.700865-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Nicht-Transferrin gebundenes Eisen (NTBI) tritt bei Menschen mit Eisenüberschuss und in einer Vielzahl anderer pathologischer Zustände auf. Bestehende NTBI-Messmethoden benöti-gen entweder teure Laborausrüstung oder bedürfen komplizierter, zeitaufwändiger Proben-vorbereitung.
Das Hauptaugenmerk dieser Untersuchung lag auf der Entwicklung einer geeigneten fluores-zenzbasierten NTBI-Messmethode durch einfache Validierung des Verfahrens für die benö-tigten Analysenbereiche. Für die Messung von NTBI wurde CP691, ein neuer Pyridon-basierter Eisen-Indikator, an einem Multititerplatten-Reader verwendet. Durch die Verwen-dung von 10% humanen Blutserums mit 1.5µM CP691 zur Messung von 0-1µM Fe(III)-Nitrilotriessigsäure, entsprechend dem benötigten Bereich von 0-10µM NTBI in unverdünn-tem humanem Blutserum aus pathologischen Zuständen, konnte erfolgreich eine Eichgerade erstellt werden (R² >0.998). Die fluorsezenzbasierte Methode wurde anschließend mit einer an ICP-MS-basierten Methode verglichen. Dies zeigte, dass mit der fluoreszenz-basierten Methode Eisen-Werte unbekannter Konzentration mit höherer Genauigkeit bestimmt werden können als mit der ICP-MS-basierten Methode. Dennoch zeigte die Anwendung der fluores-zenzbasierten Methode auf Proben humanen Blutserums wenig bis gar keine Korrelation zwi-schen der fluoreszenzbasierten Methode und bekannten HPLC-basierten Methoden, welche für die Validierung verwendet wurden. Kinetische Aspekte von CP691 wurden mit denen bekannter Eisen(III)-Chelatoren in einem Time-Course-Experiment unter Verwendung von UV/Vis-Spektroskopie verglichen. Dabei konnte CP691 Eisen, verglichen mit Deferoxamin, CP20 und CP692 am schnellsten (T1/2 = 8.7 min) aufnehmen. Weitere Versuche betreffend CP691s Potential Eisen in der Gegenwart von Fe(II)-NTA/Fe(II)-Citrat von Transferrin zu entfernen zeigten nicht nur, dass CP691 verglichen mit Apotransferrin (apo-Tf) der stärkere Eisen-Chelator ist, sondern auch, dass es Eisen von gesättigtem Transferrin entfernen kann, was bei Anwendung auf pathologisches humanes Blutserum zu falsch-positiven NTBI-Ergebnissen führen könnte.
Diese Ergebnisse zeigen, dass CP691 nicht zur Bestimmung von NTBI in pathologischem humanem Blutserum in der beschriebenen Messmethode geeignet ist.
Abstract
(Englisch)
Nontransferrin-bound iron (NTBI) appears in the serum of individuals with iron overload and in a variety of other pathologic conditions. Currently established NTBI quantification methods require either expensive laboratory equipment or involve complicated, time consuming sample preparations.
The main focus of this investigation lay on development of an appropriate fluorescence-based quantification method for NTBI through simple method validation for required levels of analysis using CP691, a novel Pyridinone iron probe, on a multi-well plate reader. A standard curve was successfully established (R² >0.998) using 10% human blood serum and 1.5µM CP691 to measure 0-1µM Fe(III) nitrilotriacetic acid, the equivalent to the common range of 0-10µM NTBI in undiluted human blood serum from pathogenic conditions. The fluorescence-based assay was then compared to an ICP-MS-based method showing that the fluorescence-based assay can determine iron levels of unknown concentration with higher accuracy than the ICP-MS-based method. However, the application of the fluorescence-based method on human blood serum samples from patients suffering from various conditions leading to iron overload did show weak to no correlation between the fluorescence-based assay and established HPLC-based assays that were used to validate the method. The kinetic aspects of CP691 with established iron(III) chelators were compared in a time course experiment using a UV/Vis-Spectroscopy based method. CP691, was found to be able to exchange iron at the fastest rate (T1/2 = 8.7 min) compared to desferrioxamine B, CP20 and CP692. Furthermore, investigations on CP691’s potential for iron removal from transferrin in the presence of Fe-NTA/Fe-citrate did not only show that CP691 is the stronger iron chelator compared to apotransferrin (apo-Tf) but it is also able to remove iron from saturated transferrin, which could be leading to false positive NTBI results when applied on pathologic human blood serum samples.
These findings suggest that CP691 should not be used on the described direct measurement method of NTBI-levels in human pathologic serum samples.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
iron NTBI Non-Transferrin-Bound Iron blood iron overload iron overload diseases
Schlagwörter
(Deutsch)
Eisen NTBI Nicht-Transferrin-gebundenens Eisen Blut Eisenüberschuss Eisenüberschusskrankheiten
Autor*innen
Robert Zika
Haupttitel (Englisch)
The quantification of non-transferrin-bound iron
Paralleltitel (Deutsch)
Die Quantifizierung von Nicht-Transferrin-gebundenem Eisen
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
XIII, 73 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Noe
Klassifikation
44 Medizin > 44.42 Pharmazeutische Chemie
AC Nummer
AC10702937
Utheses ID
22203
Studienkennzahl
UA | 449 | | |