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The role of HDAC1 and HDAC2 in transcription and induced pluripotency

Simon Weissmann

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Christian Seiser

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DOI

10.25365/thesis.24995

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30009.64368.978763-2

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die genaue Regulation der Genexpression durch transkriptionelle Kontrolle ist einer der wich- tigsten Mechanismen, die multizelluläre Organismen verwenden um ihre Zellidentität in der Ent- wicklung zu definieren oder um auf Umweltreize zu reagieren. Das Unvermögen genregulatori- sche Netzweke zu etablieren, aufrechtzuerhalten oder koordiniert zu verändern verursacht Ent- wicklungsdefekte und verschiedene pathologische Erscheinungsformen, unter anderem Krebs. Ein Mechanismus mit dem eukaryotische Zellen Transkription regulieren, ist das reversible Hin- zufügen von kleinen chemischen Gruppen, welches die Zugänglichkeit der DNA durch die tran- skriptionelle Maschinerie beeinflusst. Unter diesen Histonmodifikationen ist Histonazetylierung die am besten erforschte und repräsentiert eine dynamische und reversible Histonmarkierung, welche generell mit transkriptioneller Aktivierung assoziiert ist. Die zwei Enzymgruppen, die diese Markierung hinzufügen und wieder entfernen, sind die Histonazetyltransferasen (HATs) beziehungsweise Histondeazetylasen (HDACs). In diesem Projekt verwendeten wir eine Kombination aus in vitro und in vivo Modellen, um die Rolle der zwei homologen Enzyme, HDAC1 und HDAC2, zu untersuchen. Wir analysierten ihre Bedeutung in der Transkription auf einem genomweiten Level, indem wir groß-angelegte Ex- pressionsanalysen von HDAC1 und HDAC2 knockdown oder HDAC Inhibitor (HDI) behandel- ten F9 Teratokarzinom Zellen, mit globalen Bindemustern von HDAC1 verglichen, welche wir durch Chromatinimmunpräzipitation, gefolgt durch genomweites Sequenzierung, (ChIP-seq) generierten. Ein wichtiger Teil dieser Studie war die Optimierung der technischen Parameter während des ChIP Vorgangs, besonders die Aspekte der Antikörperqualität und des Crosslin- kens von Protein zu DNA. Zu diesem Punkt konnten wir zeigen, dass duales Crosslinken das Verhältnis von Signal zu Hintergrund verstärkt, besonders in HDAC1 ChIP-qPCR Experimen- ten und die Qualität von HDAC1 ChIP-seq Daten signifikant verbessern kann. Das Kombinie- ren von Expressions- und ChIP-seq Daten zeigte eine starke Präsenz von HDAC1 an aktiven Genen und eine überraschend niedrige Zahl an transkriptionellen Änderungen von HDAC1 ge- bundenen Genen, die durch Knockdown oder Behandlung mit HDAC Inhibitoren verursacht wurden. Dies lässt eine Beteiligung von HDAC1 an verschiedenen Schritten der transkriptio- nellen Kontrolle vermuten. Weiters wurde die verbesserte ChIP Technik verwendet um das dy- namische Bindeverhalten von HDAC1 und HDAC2 in Entwicklungsprozessen des Mäusehirns und der -epidermis zu charakterisieren. Dazu analysierten wir Gene, welche in knockout Ge- weben dereguliert waren und konnten dabei mehrere Gene identifizieren, die wichtig für Hirn- beziehungsweise Epidermisentwicklung waren und welche eine dynamische Rekrutierung von HDAC1 und HDAC2 zeigten, die die beobachteten Phenotypen beschreiben könnte. Letztlich, versuchten wir die Bedeutung von HDAC1 und HDAC2 während des Reprogrammierens von somatischen zu iPS Zellen zu ergründen. Dazu generierten wir HDAC1 und HDAC2 defizien- te embryonische Fibroblasten, durch das Einbringen eines retroviralen Vektors, welcher eine Cre-Rekombinase und ein EGFP-Reporter Gen enthielt. Wir konnten zeigen, dass die direkte Transduktion von frisch isolierten Fibroblasten höchst spezifische Knockouts erzeugte, welche aber, im Unterschied zur Behandlung durch HDIs, keine Erhöhung des Reprogrammierungs- potential erwirkten. Dies führte zu dem Schluss, dass die Deletion einer HDAC nicht den Effekt von globaler Histondeazetylasehemmung rekonstituieren kann.

Abstract

(Englisch)

The tight regulation of gene expression by transcriptional control is one of the key mechanisms used by multicellular organisms to determine cell fate identity during development or to respond to environmental stimuli. The inability to establish, maintain or alter gene regulatory networks in a coordinated fashion causes developmental defects and various pathological conditions including cancer. One mechanism by which eukaryotic cells regulate the rate of transcription is the reversible addition of small chemical moieties to histones which influences the DNA accessibility for the transcriptional machinery. Among these histone modifications, acetylation of lysine residues is the most extensively studied and represents a dynamic and reversible histone mark that is generally associated with transcriptional activation. The two groups of enzymes which add and remove this mark are the histone acetyl transferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) respectively. In this project we used a combination of in vitro and in vivo models to investigated the role of the two highly homologous enzymes HDAC1 and HDAC2. We looked into their importance during transcription on a genome-wide level by combining large-scale expression analysis of HDAC1 and HDAC2 knockdown or HDAC inhibitor treated F9 teratocarcinoma cells to global binding patterns of HDAC1, obtained by chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq). One important part of this study was to optimize technical parameters of the ChIP protocol focusing on the aspects of antibody quality and protein to DNA crosslinking. Here we could show that dual crosslinking by alternative crosslinkers can greatly enhance signal to noise ratios, especially in HDAC1 ChIP-qPCR experiments, and significantly improve the quality of HDAC1 ChIP-seq data. The combinatorial approach of expression and ChIP- seq data revealed a high presence of HDAC1 at active genes and a surprisingly low number of transcriptional changes of HDAC1 bound genes induced by knockdowns or HDAC inhibitor treatment, suggesting an involvement of HDAC1 at different steps of transcriptional regulation. Furthermore, the improved ChIP method was used to describe the molecular binding dynamics of HDAC1 and HDAC2 in the developmental processes in the murine brain and epidermis. To this end, we looked at genes that were deregulated in conditional knockout tissue and we could identify several genes which are important in epidermal and brain development and which show a dynamic recruitment of HDAC1 and HDAC2 that could partly explain the observed phenotypes. Finally, we tried to elucidate the importance of HDAC1 and HDAC2 during the process of repro- gramming somatic to induced pluripotent cells. Therefore, we generated HDAC1 and HDAC2 deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs) by the delivery of a retroviral vector containing a Cre-recombinase and an EGFP-reporter gene. We could show that a direct transduction of freshly isolated MEFs resulted in highly specific knockouts which, unlike HDAC inhibitor treat- ment, did not improve the reprogramming capacity leading to the conclusion that the deletion of one HDAC does not mimic the effect of global deacetylase inhibition.

Autor*innen

Simon Weissmann

Haupttitel (Englisch)

The role of HDAC1 and HDAC2 in transcription and induced pluripotency

Paralleltitel (Deutsch)

Die Rolle von HDAC1 und HDAC2 in Transkription und induzierter Pluripotenz

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

94 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christian Seiser

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC11158692

Utheses ID

22337

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter