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New methods for fluorescence labelling of human rhinovirus in live cell imaging
Matthias Pilecky
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Heinrich Kowalski
DOI
10.25365/thesis.25082
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29611.68857.308059-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Diese Thesis behandelt die Insertion eines RNA-Aptermers, genannt Spinach, welches mit dem kleinen Molekül DFHBI einen fluoreszierenden Komplex bildet, in das Genom des humanen Rhinovirus 14 (HRV-14). Damit soll es ermöglicht werden die virale RNA während eines gesamten Infektionszykluses in der Zelle zu beobachten um neue Erkenntnisse über die gesamte Replikation des Viruses zu erhalten, welcher am häufigsten mit der gemeinen Erkältung assoziiert ist. Die Sequenz des Aptamers musste in nicht kodierende Regionen des Genoms insertiert werden, wo auch bereits bekannte Schlüsselstrukturen wie „Cloverleaf“ und „IRES“ intakt bleiben mussten. Das reduzierte die Anzahl der möglichen Stellen auf 4 Positionen: In der 5‘-UTR jeweils vor und nach dem Cloverleaf und zwei in der 3‘-UTR. Um die Stabilität der Konstruktionen und um ungewünschte Strukturbildung vorherzusagen wurde die Vienna RNA Websuite verwendet.
Die Einfügung des Aptamers resultierte in drei Fällen in einem defekten Virus, wobei das Ausmaß von der Position des Aptamers abhing. Das vierte Konstrukt zeigte Wachstumsraten vergleichbar mit dem nativen Virus, trug jedoch ein nicht fluoreszierendes Aptamer mit sich. Zwei der drei leuchtenden rekombinanten Viren konnten in HeLa-Zellen gezüchtet werden, zeigten sich jedoch genetisch instabil und deletierten das Aptamer interessanterweise punktgenau.
Drei Konstrukte fluoreszierten in Gegenwart von DFHBI in vitro und in vivo transifiziert in HeLa Zellen. Die erste Passage von aus Plaques isolierten rekombinanten Viren zeigten ebenfalls Fluoreszenz 5 Stunden nach der Infektion.
Als ein weiteres Projekt wurde die Einführung eines Tetra-Cystein-Tags in ein Kapsidprotein (entweder VP1 oder VP2) geplant. Wegen des beschränkten Zeitrahmens konnte dies jedoch nicht während der Masterarbeit fertig gestellt werden.
Abstract
(Englisch)
We inserted an RNA aptamer called spinach which form a fluorescent complex with the small compound DFHBI into the genome of human rhinovirus 14 (HRV-14) aiming at facile dynamic fluorescent monitoring of its fate in order to gain new insight into the life-cycle of the viruses most frequently associated with the common cold. The sequence of the aptamer required insertion into non-coding regions of HRV-14, where the known key cis-regulatory elements forming conserved secondary structures like the cloverleaf or the IRES had to be kept intact. These constraints reduced the spectrum of available options to only 4 target sites: At the 5’-UTR after the two start Uracils – before the cloverleaf; at the 5’-UTR after the cloverleaf – before the IRES within the short polymorphic spacer region; or within the 3’-UTR between the end of the open reading frame and before the conserved stem-loop and between the stem-loop and poly A tract. The Vienna RNA Websuite was used to analyze for and rule out misfolding of the chimeric viral RNA as a result of aptamer tagging. We found that the insertion of spinach resulted in replication defective viruses in three instances, with severity dependent on the insertion site. The fourth construct was comparable to wild type but likely carried a misfolded inactive aptamer. Two recombinant viruses could be passaged on HeLa cells but [the virus is] proofed genetically unstable and deleted the aptamer, surprisingly without leaving behind any truncated sequences. Three chimeric RNA species became fluorescent in the presence of DFHBI in vitro and also in vivo when transfected into HeLa cells. First-generation plaque isolated recombinant viruses carrying the equivalent spinach-tagged genomic RNA gave rise to fluorescent signals in HeLa cells but only at the peak of infection (5 h post infection) which presently precludes dynamic analysis of early events such as endosomal RNA release.
As a further project we also planned to insert a tetra-cystein-tag into a capsid protein, either VP1 or VP2. However, due to limitations in time this task could not be completed within this master thesis.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
human rhinovirus Spinach FlAsH picornavirus live cell imaging fluorescence labelling
Schlagwörter
(Deutsch)
humanes Rhinovirus Spinach FlAsH Picornaviren live cell imaging Fluoreszenzmarkierung
Autor*innen
Matthias Pilecky
Haupttitel (Englisch)
New methods for fluorescence labelling of human rhinovirus in live cell imaging
Paralleltitel (Deutsch)
Neue Methoden zur Fluoreszenzmarkierung von humanen Rhinoviren für live cell Imaging
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
80 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Heinrich Kowalski
AC Nummer
AC10812512
Utheses ID
22414
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |