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Molecular studies on the transcriptional regulation of the Cd8ab gene loci during T cell development
Matthias Hombauer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Wilfried Ellmeier
DOI
10.25365/thesis.2609
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29521.62138.271462-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Expression des CD8 Co-Rezeptormoleküls wird während der Entwicklung von T Zellen streng reguliert und ist an den funktionellen Phänotyp von zytotoxischen T Zellen gekoppelt.
In vorangegangenen Experimenten konnten fünf Cd8 spezifische Enhancer Elemente identifiziert werden. Nachdem diese Cd8 cis-regulatorischen Elemente ursprünglich als große genomsiche Abschnitte (4-8kb) nachgewiesen wurden, ist es von großer Bedeutung die Kern-Enhancer Regionen zu identifizieren um diese als molekulare Köder für die Isolation von Bindungsfaktoren zu nutzen.
Von wichtigen Cd8 cis-regulatorische Elemente wird angenommen, dass sie evolutionär konserviert sind und daher wurde am Cd8 Lokus ein Sequenzvergleich verschiedener Spezies durchgeführt um evolutionär konservierte Regionen (ECRs) nachzuweisen. Dieses Experiment führte zur Identifizierung von 10 ECRs in der Größe zwischen 200bp und 500bp. Um die gefundenen Fragmente auf Ihre Enhancerfunktion zu testen wurden in vivo transgene Reporter Expressions Analysen zusammen mit in vitro Luciferase Analysen durchgeführt.
Mit Hilfe dieser Experimente konnten wir sowohl den E8I Kern-Enhancer identifizieren sowie ein neues Enhancer-Element (E8VI), welches die Cd8 Expression in CD8alphaalpha+ dendritischen Zellen reguliert, lokalisieren.
Bisherige Experimente in unserem Labor zeigten auch, dass der Cd8 Lokus epigenetisch reguliert wird.
Weiters konnten wir den Transkriptionsfaktor MAZR als negativen Regulator des CD8 Co-Rezeptormoleküls identifizieren.
Um mehr über MAZR zu lernen, generierten wir MAZR knock out Mäuse welche zu einem veränderten CD4/CD8 Verhältnis im Thmyus führten und die Ausbildung von MHC-Klasse I selektierten CD4 Zellen zeigte.
Des Weiteren konnten wir einen Anstieg der Th-POK Expression in MAZR -/- CD4+CD8lo Thymocyten feststellen, dass einen Hinweis darauf gibt, dass MAZR in der Regulierung der Th-POK Expression beteilig ist.
Durch ChIP-Experimente konnten wir zeigen dass MAZR an die Th-POK silencer Region RBS-1 bindet. Daher schlagen wir einen molekularen Mechanismus vor, bei dem MAZR an die Th-POK silencer Region RBS-1 rekrutiert wird um die Th-POK Expression zu unterdrücken.
Abstract
(Englisch)
CD8 coreceptor expression is tightly regulated during T cell development and is coupled with the functional phenotype of cytotoxic T cells. Understanding the transcriptional control mechanisms of Cd8 gene regulation will therefore provide new insights into cell fate decisions of DP thymocytes towards CD4/CD8 lineage differentiation.
Five developmental stage- and subset-specific Cd8 enhancers were identified in previous studies. However, some important aspects remain to be adressed. It is still unclear where the core enhancer regions are located within the known Cd8 enhancers. Since the Cd8 cis-regulatory elements were initially mapped on large genomic fragments (4-8kb), it is essential to identify the core enhancer regions within those fragments in order to use them as molecular baits for the isolation of binding factors. Furthermore, it is not known which cis-regulatory elements direct the expression of CD8 in CD8alphaalpha+ dendritic cells.
Important Cd8 cis-regulatory elements are expected to be evolutionary conserved, thus a cross-species comparison of the Cd8a and Cd8b genomic loci to search for evolutionary conserved regions (ECR) was performed. This approach led to the identification of 10 ECRs ranging from 200bp to 500bp. In vivo transgenic reporter expression assays and in vitro transient luciferase assays were performed to test ECR containing fragments for enhancer activity. These studies led to the identification of the E8I core enhancer and we could also identify a novel enhancer element (E8VI) that drives expression of Cd8 in CD8alphaalpha+ dendritic cells.
Previous findings of our laboratory demonstrated epigenetic control of the Cd8 gene loci. We further identified that the transcription factor MAZR acts as a negative regulator of CD8 expression. In order to learn more about the role of MAZR, we generated MAZR deficient mice and observed an altered CD4/CD8 ratio in the thymus of MAZR knockout mice as well as the development of class I-restricted CD4 lineage cells. Furthermore we observed an increase of Th-POK expression in MAZR -/- CD4+CD8lo thymocytes, indicating that MAZR might regulate the expression of Th-POK.
By using ChIP experiments we showed that MAZR is binding to the Th-POK silencer region RBS-1, indicating a molecular mechanism where MAZR is recruited to the Th-POK silencer region RBS-1 and in turn contributes to the appropriate repression of Th-POK expression.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
CD8 loci enhancer MAZR Th-POK
Schlagwörter
(Deutsch)
CD8 Lokus Enhancer MAZR Th-POK
Autor*innen
Matthias Hombauer
Haupttitel (Englisch)
Molecular studies on the transcriptional regulation of the Cd8ab gene loci during T cell development
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Studien der transkriptionellen Regulation des Cd8ab Gen Lokus während der T Zell Entwicklung
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
57 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Pavel Kovarik
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC07654107
Utheses ID
2246
Studienkennzahl
UA | 490 | | |