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Characterisation of the regulatory RNA NalA in Pseudomonas aeruginosa
Alessandra Romeo
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Udo Bläsi
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.25144
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29726.10040.448662-0
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Frei lebende oder endosymbiotischen Bakterien spielen eine zentrale Rolle im Kreislauf der verschiedenen Formen von Stickstoff, von anorganischem zu organischem Stickstoff und umgekehrt. Insbesondere wurde die Assimilation von Nitrat in komplexe Makromoleküle in Klebsiella spp, Bacillus subtilis und Azotobacter vinelandii ausgiebig untersucht. Im Gegensatz dazu haben sich Studien der Nitrat Nutzung in Pseudomonas aeruginosa, einem op-portunistischen Krankheitserreger von Menschen, vor allem auf die Nitrat-Atmung kon-zentriert, die typischerweise in Biofilmpopulationen bei einer Infektion der Lungen von Mu-koviszidose-Patienten beobachtet werden. Die P. aeruginosa Biofilme sind bekannt für ihre Resistenz gegen die Abwehrmechanismen des Wirts und antibakteriellen Behandlungen, was zu einer schlechten Prognose bei chronisch infizierten Patienten führt. Die Auswirkungen kleiner regulatorischer RNAs (sRNAs) zum Anpassen bakterieller Genexpression wurde intensiv untersucht. Ein bioinformatischer Ansatz, um intergenische Regionen von Pseudomonas aeruginosa O1 (PAO1) für kleine RNAs zu analysieren, ergab ein putatives RNA-Gen upstream des Operon nirBD-PA1779-cobA, welches für die Nitratas-similation codiert. Diese RNA, NalA (Nitrate Assimilation leader A) genannt, steht für die Leader-RNA des nirBD-PA1779-cobA Operon. Es wurde gezeigt, dass die NalA Transkripti-on, σ54 und NtrC abhängig ist. Ein PAO1 nalA Deletionsstamm und ein Stamm mit einer De-letion im ORF PA1785 kann nicht auf Nitrat wachsen. PA1785 wurde als Homolog des Azotobacter vinelandii nasT Gens identifiziert, dessen Produkt für die Transkription des A. vinelandii Nitrit / Nitrat-Reduktase-Operons gebraucht wird. Zusammengefasst zeigen diese Studien, dass transkriptionale Anti-Termination der Leader-RNA NalA für die Expression des Nitratassimilation Operons von PAO1 erforderlich ist, und dass dieser Prozess durch konser-vierte Funktionen in PAO1 und A. vinelandii reguliert wird. Der zweite Teil der Studie beschäftigt sich mit der Frage, ob NalA die Regulation von Genen in trans vermitteln kann. Eine Transkriptomanalyse in PAO1 wurde durchgeführt, um Veränderungen in der Genexpression nach einer NalA Induktion nachzuweisen. Diese Analy-se zeigte, verringerte Levels von Genen die mit der Typ IV-Pili Biogenese zusammenhängen, während die Levels der Gene, die an der oxidativen Resistenz und Gene, die im Zink Stoff-wechsel beteiligt sind erhöht waren. Um den Einfluss von NalA auf die Expression des Typ IVb Pilin FLP-Gens und des fimUpilVWXY1 Operon, das für Typ IVa Pili Biogenese erforder-lich ist zu validieren, wurden Motilitäts und Biofilm-Assays durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Expression des besonders hoch induzierten dksA2 Gens nach NalA Induktion durch die Verwendung einer transkriptionalen pdksA2-lacZ-Reportergen-Fusion untersucht. Im Widerspruch zu den Microarray-Daten, hatte NalA keinen Einfluss auf PAO1 Motilität und Bildung von Biofilmen, und der Anstieg der mRNA-Levels von dksA2 konnte nicht in Zusammenhang mit regulatorischen Ereignissen auf der Transkriptionsebene gebracht werden.
Abstract
(Englisch)
Free-living or endosymbiotic Bacteria have a central role in cycling of the diverse forms of nitrogen, from inorganic to organic and vice-versa. In particular, the assimilation of nitrate into complex macromolecules has been extensively studied in Klebsiella spp., Bacillus subtilis and Azotobacter vinelandii. In contrast, studies of nitrate utilisation in the opportunis-tic human pathogen Pseudomonas aeruginosa have mainly focused on nitrate respiration, typically observed in biofilm populations infecting the lungs of cystic fibrosis patients. P. aeruginosa biofilms are renowned for their resistance against host defences and antibacterial treatments, leading to poor prognosis in chronically infected patients. The impact of small regulatory RNAs (sRNAs) on adjusting bacterial gene expression has been intensively studied. Bioinformatic approaches employed to analyse intergenic regions of Pseudomonas aeruginosa O1 (PAO1) for small RNAs revealed a putative RNA gene encoded upstream of the nitrate assimilation operon nirBD-PA1779-cobA. This RNA, termed NalA (nitrogen assimilation leader A), represents the leader RNA of the nirBD-PA1779-cobA operon. NalA transcription is shown to be σ54 and NtrC dependent. A PAO1 nalA deletion strain and a strain bearing a deletion in ORF PA1785 failed to grow on nitrate. PA1785 was identified as a homologue of the Azotobacter vinelandii nasT gene, the product of which is required for transcription of the A. vinelandii nitrite/nitrate reductase operon. Collectively these studies revealed that transcriptional antitermination of the leader RNA NalA is required for expression of the PAO1 nitrate assimilation operon, and that this process is governed by conserved functions in PAO1 and A. vinelandii. The second part of the study addressed the question whether NalA acts in trans by mediating regulation of genes. A transcriptome analysis in PAO1 was performed to detect changes in gene expression upon NalA induction. This analysis revealed reduced levels of genes pertaining to type IV pili biogenesis, whereas the levels of genes encoding oxidative resistance functions and zinc-related metabolism were increased. To validate the influence of NalA on expression of the type IVb pilin flp gene and of the fimUpilVWXY1 operon required for type IVa pili biogenesis, motility and biofilm assays were performed. In addition, the ex-pression of the most notably induced dksA2 gene was studied following NalA induction by using a transcriptional pdksA2-lacZ reporter gene fusion. At variance with the microarray data, NalA had no influence on PAO1 motility and biofilm formation, and the increase in dksA2 mRNA levels could not be attributed to regulatory events operating at the transcriptional level.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Pseudomonas aeruginosa sRNA nitrate assimilation leader RNA gene expression Microarray
Schlagwörter
(Deutsch)
Pseudomonas aeruginosa sRNA Nitratassimilation Leader-RNA Genexpression Microarray
Autor*innen
Alessandra Romeo
Haupttitel (Englisch)
Characterisation of the regulatory RNA NalA in Pseudomonas aeruginosa
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung der regulatorischen RNA NalA in Pseudomonas aeruginosa
Publikationsjahr
2012
Umfangsangabe
153 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Renée Schroeder ,
Karine Lapouge
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11005668
Utheses ID
22469
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |
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