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hsa-miRNA-663 in replicative and DNA damage induced senescence of human dermal fibroblasts
Kathrin Ingrid Garschall
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Andrea Barta
DOI
10.25365/thesis.26638
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29367.42100.469565-0
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Altern ist ein biologischer Prozess, den man von der Zelle bis zur Gesamtorganismus beobachten kann und der durch einen fortschreitenden Funktionsverlust gekennzeichnet ist welcher zu Krankheiten und letztlich zum Tod führt. Auf zellulärer Ebene sind die grundlegenden Mechanismen die zur Seneszenz führen, ein Schutz vor ungebremster Proliferation und damit Hindernis bei der Entstehung von Krebs. So fließen in die Regulation Informationen über DNA Integrität, reaktive Stoffwechselprodukte und den generellen Stressstatus der Zelle ein. Können die Schäden nicht repariert werden, so werden komplexe verflochtene Signalwege aktiviert, wodurch die Zelle in Apoptose oder finalen Wachstumsarrest geht.
Eine Ebene dieser Regulierung findet über microRNAs statt: kurze RNAs, welche über RNA Interferenz die Stabilität von mRNAs beeinflussen. Eine miRNA kann, weil dafür keine 100%ige Komplementarität notwendig ist, mehrere verschiedene mRNAs regulieren.
In einem Vorversuch wurde in hsa-miR-663 eine miRNA gefunden die in der zellulären Seneszenz von menschlichen Hautfibroblasten hoch reguliert ist und von der bioinformatisch bestimmt wurde, dass sie die Zellzyklusphosphatase PP5 binden könne. PP5 wirkt mit in der Regulation von vielen Signalewegen für die für die Seneszenz entscheidend sind und beeinflusst auch die Aktivität eines der wichtigsten zellulären Stress Mediatoren: p53. Unter anderem induziert p53 die Transkription von p21, der als Zellzyklus Inhibitor einen G1 arrest auslösen kann.
Dies direkte Interaktion zwischen miR-663 und PP5 wollten wir mithilfe eines Reporter-Gen-Vektors bestätigen: wir koppelten die 3‘ untranslatierte Region (3’UTR) von PP5 an eine Luciferase und wollten RNA Interferenz – ausgelöst durch die Bindung von miR-663 - über ein vermindertes Luciferase signal detektieren. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch kein eindeutiger Hinweis für eine direkte Interaktion zwischen miR-663 und der 3‘UTR gesehen. Als Folge von Überexprimierung von miR-663 sahen wir eine Reduktion an zellulärem PP5 Protein Gehalt, der sich auf mRNA Ebene nicht widerspiegelte und reduzierte Level an p21 mRNA. Einen Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Zellen – ermittelt durch den Einbau von BrdU während der DNA Replikation – konnte weder in Zellen gesehen werden, die mit miR-663 transfeziert wurden, noch in solchen, deren PP5 mithilfe einer siRNA reduziert wurde. Die Behandlung von humanen Fibroblasten mit einer H2O2 um DNA Schäden zu induzieren führte zu einer Zunahme an p21 mRNA, welche jedoch nicht mit der Menge an PP5 mRNA oder dem Level an miR-663 korrelierte.
Abstract
(Englisch)
Aging is a multifactorial and highly regulated process that starts on cellular level and finally affects the whole individual with tissue deterioration, leading to disease and an increased probability of death with the progression of lifetime. Based on the findings, that hsa-miRNA-663 is upregulated in the cellular senescence of human diploid fibroblasts (HDF), we aimed to further elucidate the role of this small non coding RNA, which was recently shown to act as tumor promoter or suppressor dependent on cancer cell type. A bioinformatical target prediction matched its seed region to the cell cycle phosphatase PP5, a ubiquitous protein that interferes with multiple pathways of proliferation, DNA damage and apoptosis signaling. PP5 also participates in the regulation of the cellular stress mediator p53 that – amongst many other functions - can induce transcription of p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor 1) to promote a cell cycle arrest in G1 phase.
Although we could not verify a direct interaction between miR-663 and PP5 using a dual luciferase reporter system, we found that transient induction of miR-663 correlates with reduced abundance of PP5 protein yet not with a consistent reduction of PP5 mRNA. We found that induction of miR-663 and siRNA mediated knockdown of PP5 both reduced the levels of p21 mRNA but had no effect on the proliferative potential, assayed by BrdU incorporation. Finally were able to show an increase in p21 mRNA upon treatment of HDF with sublethal doses of hydrogen peroxide, which did not correlate with the levels of miRNA-663 or PP5 mRNA.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Senescence human fibroblasts miRNAs hsa-miRNA-663 PP5
Schlagwörter
(Deutsch)
Seneszens humane Fibroblasten miRNAs hsa-miRNA-663 PP5
Autor*innen
Kathrin Ingrid Garschall
Haupttitel (Englisch)
hsa-miRNA-663 in replicative and DNA damage induced senescence of human dermal fibroblasts
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von hsa-miRNA-663 in der replikativen und durch DNA Schäden induzierten Seneszens humaner Hautfibroblasten
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
77 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Andrea Barta
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11738006
Utheses ID
23818
Studienkennzahl
UA | 490 | | |