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Regulatory tools and the characterization of insulinergic cells in the annelid Platynereis dumerilii
Benjamin Backfisch
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Florian Raible
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.27157
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-16420.58610.269775-2
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Das Hauptziel dieser Arbeit war die vergleichende Analyse von insulinergen Zellen und deren Regulation in Larven sowie in adulten Stadien des Meeresringelwurms Platynereis dumerilii. In dieser Studie wurden fünf verschiedene insulin-ähnliche Peptidhormone (Insuline) in Platynereis beschrieben, welche in neurosekretorischen Zellen der Gehirne von Larven und adulten Würmern exprimiert sind. Basierend auf verbesserten in-situ Färbemethoden, welche im Zuge dieser Arbeit entwickelt wurden um Genexpressionsmuster in adulten Würmern zu erforschen, analysierte ich die Expressionsmuster bekannter Insulin-Regulatoren aus Wirbeltieren und entdeckte, dass deren Platynereis-Orthologe lMaf, pax6 und islet mit insulinergen Zellen der Gehirne von Larven beziehungsweise adulte Stadien assoziiert sind. Weitere molekulare Analysen der insulinergen Zellen in Platynereis ergaben, dass die Zentren der Insulin-Expression und der circadianen Uhr miteinander assoziiert sind und Insuline in einem 24-Stunden Rhythmus exprimiert werden, welcher auch unter konstant dunklen Bedingungen beibehalten wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in Platynereis die Expression von Insulinen von der circadianen Uhr kontrolliert wird und dass es sich dabei möglicherweise um einen alten Mechanismus handelt, der Stoffwechselprozesse und die circadiane Uhr aufeinander abstimmt. Hinweise auf eine Funktion der Platynereis Insuline im Nahrungsstoffwechsel wurden in dieser Studie aufgezeigt, die auf eine konservierte Funktion der Platynereis Insuline im Kohlenhydrat-Stoffwechsel hindeuten. Darüber hinaus wurde in dieser Studie eine Funktion der Infracerebral-Drüse als ein den Blutzuckerspiegel messendes Organ vorgeschlagen und ein möglicher Mechanismus der Insulin-Sekretion in Platynereis diskutiert. Die Ergebnisse dieser Studie liefern neue Einblicke in die Regulation Insulin-ähnlicher Peptide im Modellorganismus Platynereis dumerilii, die möglicherweise altertümliche Eigenschaften in der Transkription und Funktion von Insulinen und ihrer Verbindung zu der circadianen Uhr widerspiegeln. Darüber hinaus stützen die Ergebnisse die Hypothese, nach der insulinerge Zellen neuronalen Ursprungs sind. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden, die die Markierung von Zellen in lebenden Larven und adulten Tieren ermöglichen. Mithilfe eines Mirkoinjektionsprotokolls für Zygoten und Transposon-basierter Plasmid-Vektoren gelang mir die Etablierung der ersten stabilen transgenen Reporterlinien im Modellorganismus Platynereis dumerilii. Darüber hinaus entwickelte ich Methoden, die transiente Transgenese in Platynereis dumerilii ermöglichen. Eine auf dem Transposon Mos1 basierende fluoreszente Reporterlinie, die die endogene Expression von r-opsin, einem charakteristischen Marker-Gen stäbchenförmiger Fotorezeptorzellen widerspiegelt, führte zu der Entdeckung von Fotorezeptorzellen außerhalb des Kopfes, die sich im Bereich des Bauchmarks und der Beinchen befinden. Diese Fotorezeptorzellen entwickeln sich unabhängig von pax6, einem Gen, das für die Augenentwicklung in vielen mehrzelligen Tieren zuständig ist und ähneln damit dem sogenannten Hesse-Organ, das im Lanzettfischchen beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde in dieser Studie eine weitere transgene Reporterlinie etabliert, die die Expression des Fluoreszenzfarbstoffs EGFP unter der Kontrolle des Enhancers von alpha-tubulin treibt und die es erlaubt, ziliäre Zellen während früher Entwicklungsstadien zu verfolgen. Untersuchungen der transgenen Reporterlinien ergab, dass Mos1 basierte Reporterkonstrukte ins Genom von Platynereis dumerilii integriert und vererbt werden und in den Folgegenerationen exprimiert sind. Die Untersuchungen zeigen, dass auf dem Transposon Mos1 basierende Plasmid-Vektoren geeignet sind, um in Platynereis stabile transgene Reporterlinien zu erzeugen. Um transiente Transgenese in Platynereis zu erforschen, verwendete ich ein auf dem Transposon Tol2 basierendes fluoreszentes Reporterkonstrukt, welches die Expression von EGFP unter der Kontrolle des Enhancers von rps9 treibt, eines Komponenten der S40 ribosomalen Untereinheit. Dieses Reporterkonstrukt resultiert in einer starken Expression von EGFP in allen Zellen des Tieres. Zygoten, die mit diesem Reporterkonstrukt und synthetisch hergestellter Tol2 Transposase mRNA co-injiziert wurden, entwickelten sich zu komplett grün leuchtenden adulten Tieren. In Kontrast dazu, brachten die injizierten Tiere keinen fluoreszenten Nachwuchs hervor, was möglicherweise daran liegt, dass das Reporterkonstrukt gesilenced wurde. Hierfür spricht, dass aus dem Nachwuchs fluoreszenter Elterntiere egfp-kodierende Sequenzen mittels PCR amplifiziert werden konnten. Injektionen Tol2-basierter Reporterkonstrukte führen zu einer hohen Anzahl an Tieren, die ein komplettes Expressionsmuster des Reporters zeigen und daher ist das Tol2 Transposon für transiente Transgenese in Platynereis geeignet. Die Etablierung transienter Transgenese und transgener Reporterlinien sind außerordentlich wertvolle Methoden bei der Charakterisierung und funktionalen Analyse von Zelltypen in Larven, sowie in adulten Tieren und schließen eine Lücke im Spektrum molekularbiologischer Methoden, die derzeit im Modellorganismus Platynereis dumerilii zur Verfügung stehen. Die hier vorgestellten Methoden werden dabei nützlich sein, offene Fragen in der Entwicklungs- und Evolutionsbiologie, sowie der Chronobiologie mithilfe des Modells Platynereis dumerilii adressieren.
Abstract
(Englisch)
A main focus of this study was the comparative analyses of insulinergic cells in the marine annelid Platynereis dumerilii to study their regulation in larvae and adult animals. I have identified 5 different Platynereis insulin-like peptides that are specifically expressed by neurosecretory cells in the larval and postlarval brain. Based on optimized in-situ staining protocols that I developed to study gene expression patterns in adult worms, I analyze the expression of known vertebrate insulin regulators and found that Platynereis lMaf, pax6 and islet genes are associated with insulinergic cells in larval and postlarval brains, respectively. Further molecular analyses of Platynereis insulinergic cells revealed, that insulin-like peptides are associated with centers of clock gene-expression and exhibit a 24-hour rhythm of expression, which is maintained even under constant darkness. These findings suggest that the expression of Platynereis insulin like peptides may be under the control of the circadian clock, possibly reflecting an ancient mechanism to integrate metabolic processes and the circadian clock. Evidences for a function of Platynereis insulin-like peptides in nutrient metabolism were shown in this study, which implies that Platynereis insulin-like peptides have a conserved role in carbohydrate metabolism. Moreover, a role for the Platynereis infracerebral gland as blood glucose-sensing organ was proposed and a mechanism of insulin secretion was suggested in this study. The findings of this study provide new insights into the regulation of insulin-like peptides in Platynereis and indicate possibly ancient features of insulin transcription, their function and interconnection to the circadian clock in bilaterian animals. Moreover, the findings support the hypothesis that insulinergic cells are of neuronal origin. Another goal of this work was to develop methods to label cells in Platynereis dumerilii larval and postlarval stages in vivo. Based on an optimized zygotic microinjection protocol and specific transposon-derived vectors, I generated the first stable transgenic strains and established a robust protocol for transient transgenic applications in Platynereis. A Mos1-derived transgenic fluorescent reporter line that recapitulates the endogenous expression of r-opsin, a characteristic marker for rhabdomeric photoreceptors, led to the discovery of non-cephalic photoreceptors. Molecular analysis of these non-cephalic photoreceptors revealed that they differentiate independent of pax6, a gene that is involved in eye development in many metazoans, and that they could share a common origin with the amphioxus Hesse organ. Moreover, a second transgenic strain was established that drives expression of EGFP under the control of cis-regulatory elements of an alpha-tubulin gene that enables to trace ciliated cells during development of the early trochophore larva. Analyses of the transgenic reporter lines revealed that Mos1-derived transgenes are integrated into the genome and are transmitted and expressed in subsequent generations. These findings establish that the Mos1 transposon is a suitable tool to generate transgenic strains in Platynereis dumerilii. I explored transient transgenic approaches in Platynereis using a tol2-derived fluorescent reporter construct for rps9, a component of the ribosomal 40S subunit that drives ubiquitous EGFP expression. Zygotes that were co-injected with the rps9 reporter along with synthetic tol2 transposase mRNA gave rise to fully fluorescent adult animals. No EGFP expression was observed in the offspring of injected animals which might reflect a permanent silencing of the reporter, since egfp coding sequence can still be amplified from non-fluorescent batches derived from transgenic parents. Notwithstanding, Tol2-based vectors yield high numbers of complete expression patterns of transgenes in the injected animals and hence, Tol2-derived constructs are suitable tools for transient transgenic applications in Platynereis. The establishments of transient transgenic technology and stable transgenic strains reported in this study, provide unprecedented tools to characterize and functionally study cell types throughout the lifetime of the animal. Moreover, the methodology described in this study, fills a critical gap in the toolkit currently available for Platynereis dumerilii and will help to address open biological questions in both developmental and evolutionary biology, as well as chronobiology.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
Platynereis dumerilii Transgenesis Insulin Evolution worm
Schlagwörter
(Deutsch)
Platynereis dumerilii Transgenese Insulin Evolution Wurm
Autor*innen
Benjamin Backfisch
Haupttitel (Englisch)
Regulatory tools and the characterization of insulinergic cells in the annelid Platynereis dumerilii
Paralleltitel (Deutsch)
Die Etablierung regulatorischer Techniken und die Charakterisierung von insulinergen Zellen im Annelid Platynereis dumerilii
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
164 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Ulrich Technau ,
Maria Ina Arnone
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.21 Evolution ,
42 Biologie > 42.23 Entwicklungsbiologie
AC Nummer
AC11009989
Utheses ID
24280
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |
Universität Wien, Universitätsbibliothek, 1010 Wien, Universitätsring 1