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Investigating substrate specificities of picornaviral proteinases by mutational analysis
David Neubauer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Timothy Skern
DOI
10.25365/thesis.2799
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30160.65443.501270-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Picornaviren sind kleine Viren ohne Lipidhülle, die die Symmetrie eines Ikosaeders aufweisen. Die Familie der Picornaviren wird in neun Genera geteilt und enthält wichtige Pathogene für Mensch und Tier. Als Genom besitzen Picornaviren RNA mit positiver Polarität. Dieses besitzt nur einen offenen Leserahmen von dem ein Polyprotein abgelesen wird. Um die einzelnen viralen Proteine zu erhalten wird dieses von viralen Proteasen prozessiert. In humanen Rhinoviren (HRV) führt dabei die Chymotrypsin-ähnliche Protease 2Apro den ersten Schnitt durch. In einer intramolekularen (cis) Reaktion spaltet sie das Polyprotein zwischen dem C-Terminus des vorangehenden strukturellen Proteins VP1 und ihrem eigenen N-Terminus. Die Prozessierung des Polyproteins der Maul-und-Klauenseuche (FMDV) wird von der Leader Protease (Lpro) eingeleitet. Diese Papain-ähnliche Protease spaltet das Polyprotein zwischen ihrem eigenen C-Terminus und dem N-Terminus des strukturellen Proteins VP4. Es ist bekannt, dass diese Reaktion prinzipiell in cis (intramolekular) oder trans (intermolekular) möglich ist. Allerdings wurde gezeigt, dass in vivo wahrscheinlich die intramolekulare Reaktion bevorzugt wird. Die Translation von zellulären gecappten mRNAs ist in HRV oder FMDV infizierten Zellen stark eingeschränkt. Dieses als Abschaltung der Wirtszelle bekannte Phänomen wird durch die Proteasen 2Apro (HRV) beziehungsweise Lpro (FMDV) verursacht. Beide sind fähig den eukaryotischen Initiationsfaktor 4G der Wirtszelle spezifisch zu spalten. Dieser arbeitet als Verbindungsprotein im Translationsinitiationskomplex. Durch die Spaltung dieses Proteins ist es der Wirtszelle nicht mehr möglich die eigenen gecappten mRNAs zur 40S Untereinheit der Ribosomen zu rekrutieren. Die virale RNA ist aber nicht gecappt. Ihre Translation wird intern über ein sogenanntes internes ribosomales Eintrittssegment (IRES) initiiert. Die Translation dieser viralen RNAs ist deshalb trotzdem möglich und der Virus übernimmt die Kontrolle über die Translationsmaschinerie der Wirtszelle. Die von HRV2 und HRV14 2Apro bei der Selbstprozessierung benutzten Schnittstellen sind nicht konserviert. Wie wir hier zeigen, kann die Schnittstelle aus HRV14 von HRV2 2Apro nicht akzeptiert werden. Die Suche nach der minimalen Anzahl an HRV14 Resten die dies verursachen ergab, dass HRV14 Reste auf beiden Seiten der Spaltstelle eingeführt werden müssen um HRV2 2Apro daran zu hindern die Schnittstelle zu erkennen. Außerdem wurde entdeckt, dass die Aminosäure Proline an Position P2‘ für die Erkennung des Substrates der HRV2 2Apro wichtig ist. Über dies hinaus konnten wir beweisen, dass die Anforderungen an das Substrat in der cis Reaktion nicht zwingendermaßen mit den Anforderungen der trans Reaktion übereinstimmen müssen. Schnittstellen die bei der Spaltung von Proteinen des nuklearen Porenkomplexes in trans von HRV2 2Apro benutzt werden, wurden in der cis Reaktion nicht akzeptiert. In der Kristallstruktur von HRV2 2Apro ist der N-Terminus vom aktiven Zentrum weggedreht. Dies entspricht der Situation nach der Prozessierung in cis. Um die Selbstprozessierung aber möglich zu machen, muss der N-Terminus neu angeordnet werden. Es wurde bereits vorgeschlagen, dass Met5 als Angelpunkt fungieren könnte an dem der N-Terminus in das aktive Zentrum gedreht wird. Dadurch würde die Seitenkette von Met5 nahe der positiv geladenen Seitenkette von Lys109 positioniert. Deshalb nahmen wir an, dass die Aminosäure Arginin an Position P5 von HRV2 2Apro nicht akzeptiert werden würde. Wir zeigen hier allerdings, dass diese Theorie falsch war. Ein weiteres Experiment sollte helfen, die Unterschiede in der Substratspezifität von HRV2 und HRV14 2Apro zu verstehen und zielte auch darauf ab, eventuell vorhandene mechanistische Unterschiede aufzuklären. Dabei versuchten wir aktive 2Apro Hybride zu konstruieren, die aus der N-terminalen Domäne der HRV14 2Apro und der C-terminalen Domäne der HRV2 2Apro bestehen. Unglücklicherweise waren diese Hybride vollständig inaktiv weshalb nur sehr wenig schlüssige Information aus diesen Experimenten gewonnen werden konnte. Schließlich sollte auch noch der Einfluss des Proteins 2B auf die Selbstprozessierung der HRV2 und HRV14 2Apro und deren unterschiedliche Reaktion auf den Inhibitor zVAM.fmk getestet werden. Wir konnten zeigen, dass in Anwesenheit des Proteins 2B die Selbstprozessierung leicht verzögert abläuft. Unsere zVAM.fmk Bestände stellten sich aber leider als zu alt heraus, weshalb diese Experimente verschoben werden mussten. Abgesehen von diesen Experimenten wurde auch die S2 Tasche der Leader Protease (Lbpro) untersucht. Es wurde gezeigt, dass Leu143 eine wichtige Determinante ist um Phenylalanin nicht in diese Tasche eindringen zu lassen. Leu143 an dieser Position ist aber nicht unter allen FMDV Stämmen konserviert. Manche Stämme besitzen auch Methionin an dieser Stelle. Deshalb testeten wir, ob auch Methionin diese Aufgabe erfüllen kann. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass auch Methionin fähig ist, Phenylalanin aus der S2 Tasche zu verdrängen. Diese Fakten legen nahe, dass es von biologischer Relevanz für den Virus ist, Substrate mit Phenylalanin an P2 nicht zu spalten.
Abstract
(Englisch)
Picornaviruses are small, non-enveloped, icosahedral viruses with an RNA genome of positive sense. The family is subdivided into nine genera that contain important human and animal pathogens. The genome contains only one large open reading frame from which a polyprotein is translated. This polyprotein is then processed by viral proteinases in order to obtain the mature viral proteins. The chymotrypsin-like proteinase 2Apro performs the initial cleavage of this processing in human rhinoviruses (HRV). It cleaves between the C-terminus of the preceding structural protein VP1 and its own N-terminus in an intramolecular (cis) reaction. In foot and mouth disease virus (FMDV), the first cleavage in polyprotein processing is performed by the leader protease (Lpro). This papain-like proteinase cleaves between its own C-terminus and the N-terminus of the structural protein VP4. Lpro was shown to be able to do so in both cis (intramolecular) or in trans (intermolecular) reactions. However, it has been found that the reaction is most likely intramolecular in vivo.
Cells infected with HRVs or FMDV were found to be severely impaired in translation of their own capped mRNAs. This phenomenon, called the host cell shut-off, has been shown to be caused by either 2Apro (HRV) or Lpro (FMDV). Both of these proteinases were found to specifically cleave the host cell factor eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G). eIF4G acts as a scaffolding protein in the translation initiation complex. Thus, the cell can no longer recruit its capped mRNAs to the 40S ribosomal subunit when eIF4G is cleaved. In contrast, viral RNA is uncapped and translation is initiated via an internal ribosomal entry segment (IRES). Therefore, translation of viral RNAs is still possible and the virus can take over the host cell translation machinery.
The cleavage sites used in the self-processing reaction by HRV2 and HRV14 2Apro are not conserved. We show here that HRV2 2Apro is not able to accept the cleavage site of HRV14. The search for the minimal number of HRV14 residues that are able to cause this inability revealed that HRV14 residues at both sides of the cleavable bond are necessary to prevent HRV2 2Apro from processing and that proline at P2’ is important for HRV2 2Apro to recognize its substrate. Furthermore, we were able to show that substrate requirements in cis do not necessarily need to fit the requirements in trans. Cleavage sites that were found to be utilized by HRV2 2Apro in the cleavage of nuclear pore complex proteins could not be accepted in cis.
In the crystal structure of HRV2 2Apro, the N-terminus is turned away from the active site and gives a picture of the protease after self-processing. Therefore, a rearrangement of the N-terminus will be needed to allow self-processing. It has been suggested that Met5 could act as a hinge at which the N-terminus is rotated into the active site. We speculated that this rotation would bring the side chain of Met5 close to the positively charged side chain of Lys109 and that for this reason an arginine could not be accepted at P5. However, we could show that this idea was false. Another approach aimed to help to understand the differences in substrate requirements of HRV2 and HRV14 2Apro and to reveal possible mechanistic differences in the self-processing of these two proteinases. For this purpose, we tried to construct active 2Apro hybrids made up of the N-terminal domain of HRV14 2Apro and the C-terminal domain of HRV2 2Apro. Unfortunately, the 2Apro hybrids were totally inactive and therefore only little information could be obtained by these experiments. Finally, the influence of the protein 2B on 2Apro self-processing and on the different behavior of HRV2 and HRV14 2Apro in respect to the inhibitor zVAM.fmk was to be explored. We show here that self-processing is slightly delayed in the presence of 2B. As our zVAM.fmk stocks were found to be out of date, these experiments had to be postponed.
In a last set of experiments, we investigated the S2 pocket of Lbpro. It has been shown that Leu143 is an important determinant in discriminating phenylalanine from protruding into the S2 pocket. Leu143 is not conserved amongst FMDV strains. Also methionine can be found at this position. Thus, we tested whether methionine was able to maintain this specificity. We were able to show that methionine exhibits similar ability to discriminate phenylalanine, indicating that not cleaving substrates with phenylalanine has biological relevance for the virus.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
picornaviruses rhinovirus foot and mouth disease protease proteinase substrate specificity mutational analysis self-processing HRV FMDV
Schlagwörter
(Deutsch)
Picornaviren Rhinoviren Maul- und Klauenseuche Protease Substratspezifität Mutationsanalyse Selbstprozessierung HRV FMDV
Autor*innen
David Neubauer
Haupttitel (Englisch)
Investigating substrate specificities of picornaviral proteinases by mutational analysis
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung der Substrat-Spezifität von picornaviralen Proteasen durch Mutationsanalyse
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
107 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Timothy Skern
AC Nummer
AC08017514
Utheses ID
2430
Studienkennzahl
UA | 419 | | |