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Functionalized gold-nanoparticles for bioanalysis
Helmut Hinterwirth
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Michael Lämmerhofer
DOI
10.25365/thesis.27284
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29546.93470.826853-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Anwendung von Goldnanopartikeln (GNP) ist wegen ihrer einzigartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften in verschiedensten wissenschaftlichen Gebieten weitverbreitet. Ein Grund für deren Attraktivität ist die einfache größengesteuerte Synthese. Des Weiteren kann eine einfache und direkte Oberflächenfunktionalisierung mit Thiol-Liganden erfolgen, wobei die starke Gold-Schwefel Bindung ausgenutzt wird, um eine selbst-assemblierende Monoschicht zu formen. Funktionalisierte GNPs bieten ein weites Spektrum an Immobilisierungs- und Biokonjugationschemie, abhängig von Nanopartikelgröße und den verwendeten Liganden.
Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit dem Einfluss der Goldnanopartikelgröße und der Liganden auf die Bioaktivität von immobilisierten Enzymen bzw. Antikörpern (Ak) sowie mit der Reduzierung von unspezifischen Bindungsphänomenen. Dabei wurde eine neue Methode entwickelt, um die Ligandendichte auf GNP zu bestimmen. Diese beruht auf dem linearen Zusammenhang zwischen dem Gold/Schwefel Verhältnis und der GNP-Größe. Die gleichzeitige Messung von Gold und Schwefel mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma als Ionenquelle wurde sorgfältig validiert und die exakte Größe der Nanopartikel mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bestimmt. Der Einfluss der Nanopartikelgröße und Liganden unterschiedlicher Kettenlängen und hydrophiler/lipophiler Eigenschaften auf die Bioaktivität von auf GNP immobilisiertem Trypsin wurde durch tryptischen Verdau von Proteinen optimiert. Die optimisierte Immobilisierungschemie wurde weiters für die Immobilisierung von Antikörpern auf GNP verwendet und mit der direkten Bindung über Protein G verglichen. Die erfolgreiche Biokonjugationschemie konnte durch die spezifische Extraktion und Anreicherung von oxidiertem Lipoprotein niederer Dichte (oxLDL, oxidiertes low-density lipoprotein, Biomarker für Arteriosklerose) gezeigt und die Dissoziationskonstante Kd bestimmt werden. Die sensitive Detektion von extrahiertem und angereichertem oxLDL und insbesondere von oxidiertem Phosphatidylcholin mittels GNP-Ak Biokonjugat erfolgte mittels Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie. Des Weiteren erlaubt die Bestimmung von Kd von einzelnen oxidierten Phospholipiden die Analyse der Ak-Spezifität und Affinität für verschiedene anti-oxLDL-Ak.
Insgesamt wurde die Biokonjugationschemie von der größengesteuerten Synthese von GNPs hin zur Oberflächenfunktionalisierung und Bestimmung der Ligandendichte auf die Bioaktivität von immobilisierten Proteinen systematisch untersucht. Funktionalisierte GNPs bieten ein nützliches Werkzeug für bioanalytische Fragestellungen, jedoch ist die Feinregulierung der Nanopartikelgröße und Immobilisierungschemie ein kritischer Faktor für die Bioaktivität.
Abstract
(Englisch)
Gold nanoparticles (GNPs) are widely used in various nanoscale applications due to their unique physical and chemical properties. Furthermore, GNPs prepared by size-controlled synthesis can be modified by straightforward surface functionalization with thiol containing ligands, which form a self-assembled monolayer utilizing the strong dative gold-sulfur bond. Functionalized GNPs offer a broad range of immobilization and bioconjugation chemistries depending on the nanoparticle size and the properties of the ligands used.
The present dissertation focuses on the optimization of the surface chemistry of nanoparticle-biocatalysts and affinity traps. Therefore, the influence of GNP size and type of spacer and linking ligands, respectively, on the bioactivity of immobilized enzymes and antibodies (Abs) as well as the reduction of unspecific binding was thoroughly investigated. We developed a new method to determine the ligand coverage onto GNPs based on the linear relationship of gold/sulfur ratio and GNP size, whereby the simultaneous measurement of gold and sulfur by inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICPMS) was carefully validated and the accurate size of GNPs determined by transmission electron microscopy (TEM). The influence of GNP size and ligands with different chain lengths and hydrophilicity/lipophilicity on the bioactivity of immobilized trypsin was studied by tryptic digestion of proteins. The optimized protocol was used for immobilization of Abs onto GNPs and compared to directed attachment via protein G binding. The successful immobilization chemistry was utilized for development of functionalized GNP extraction and enrichment of oxidized low-density lipoproteins (oxLDL) as biomarkers for e.g. atherosclerosis. For this purpose, anti-oxLDL-Abs were bound to GNPs and the dissociation constant Kd was determined. The specific extraction of oxLDL and in particular of oxidized phosphatidylcholines (oxPCs) with GNP-Ab bioconjugate was accomplished by sensitive detection with liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS/MS). Furthermore, the determination of Kd for specific oxidized phospholipids out of oxLDL allowed the identification of antibody specificity and affinity of several anti-oxLDL-antibodies.
In summary, the systematic study of bioconjugation chemistry from GNP size-controlled synthesis over surface functionalization and determination of ligand density to the influence on bioactivity of immobilized proteins is investigated in this thesis. Functionalized GNPs are a useful tool in bioanalysis, however, the bioactivity has to be controlled by fine-tuning of nanoparticle size and immobilization chemistry.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Size-controlled synthesis Characterization Surface functionalization Ligand coverage Bioconjugation chemistry Immobilization chemistry Trypsin Antibody Biomarker Mass spectrometry
Schlagwörter
(Deutsch)
Größengesteuerte Synthese Charakterisierung Oberflächenfunktionalisierung Ligandendichte Biokonjugationschemie Immobilisierungschemie Trypsin Antikörper Biomarker Massenspektrometrie
Autor*innen
Helmut Hinterwirth
Haupttitel (Englisch)
Functionalized gold-nanoparticles for bioanalysis
Paralleltitel (Deutsch)
Funktionalisierte Gold-Nanopartikel für die Bioanalytik
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
205 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Stephan Hann ,
Karel Lemr
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.18 Kolloidchemie, Grenzflächenchemie ,
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie ,
35 Chemie > 35.29 Chromatographische Analyse, Elektrophorese ,
35 Chemie > 35.60 Metallorganische Verbindungen ,
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.77 Kohlenhydrate ,
35 Chemie > 35.78 Lipide
AC Nummer
AC11336803
Utheses ID
24395
Studienkennzahl
UA | 091 | 419 | |