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The role of the tRNA ligase complex in neuronal RNA granules

Therese Kaufmann

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Javier Martinez

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DOI

10.25365/thesis.27471

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30318.08092.622454-3

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Transfer RNAs (tRNAs) ermöglichen Gen Expression indem sie die Messenger RNA (mRNA) entschlüsseln und Aminosäuren zum Ort der Proteinsynthese transportieren und an die wachsende Polypeptidkette hängen. Bevor tRNAs ihre unerlässliche Aufgabe ausführen können müssen sie erst prozessiert und modifiziert werden. Manche tRNAs enthalten außerdem intervenierende Sequenzen (Introns), die durch eine Endonuklease entfernt werden. Die entstandenen tRNA Hälften werden durch die sogenannte tRNA Ligase HSPC117 verknüpft, um schließlich die reife tRNA zu bilden. HSPC117 tritt in einem fünfteiligen Komplex auf, zusammen mit den Proteinen DDX1, FAM98B, CGI-99 und Ashwin. Abgesehen von ihrer Rolle beim Spleißen von tRNAs wurden die Proteine des tRNA Ligase Komplex vermehrt auch in einem anderen Zusammenhang erwähnt: HSPC117, DDX1, FAM98B und CGI-99 wurden in RNA-Protein-Aggregaten im Cytoplasma von Neuronen gefunden. Je nach Zusammensetzung und Funktion können diese Granula unterschiedliche Aufgaben erfüllen wie z.B. Lokalisierung von mRNAs in der Peripherie um lokale Proteinbiosynthese zu ermöglichen, Schutz und Aufbewahrung von mRNAs während Stress oder Regulierung des mRNA Zerfalls. Um zu hinterfragen ob der tRNA Ligase Komplex eine zweite Funktion, zusätzlich zum Spleißen von tRNAs im Zellkern im Cytoplasma von Neuronen hat, haben wir die Lokalisation der einzelnen Proteine untersucht. Durch Immunofluoreszenz und proteomische Analyse von Neuriten haben wir die überraschende Feststellung gemacht, dass sich nicht alle Komplex-Bestandteile in den gleichen Kompartimenten aufhalten. Zusätzlich konnten wir beobachten, dass unter Stress nur HSPC117 und DDX1 eine Verlagerung in Granula ähnliche Strukturen im Cytoplasma erfahren, was uns zu der Annahme führt, dass die Lokalisation mancher tRNA Ligase Proteine durch äußere Stimuli reguliert werden kann. Um die Folgen des Fehlens von HSPC117 in vivo untersuchen zu können und dadurch der Aufklärung über die Funktion von HSPC117 in Neuronen etwas näher zu kommen, haben wir eine Maus mit einem Neuronen-spezifischen HSPC117 Knockout gezüchtet (HSPC117fl/fl Nestin Cre). HSPC117fl/fl Nestin Cre Mäuse leiden unter perinataler Mortalität und zeigen starke Abnormalitäten spezifischer Gehirnregionen. HSPC117fl/fl Nestin Cre Primärneuronen weisen eindeutige Unterschiede zu Kontrollneuronen auf und zeigen Ansammlungen von FMRP enthaltenden Granula. Unsere Ergebnisse geben einen ersten Hinweis darauf, dass HSPC117 auch im Cytosol aktiv ist und eine bis jetzt unerkannte Rolle zusätzlich zum Spleißen von tRNA spielen könnte. Weitere Versuche betreffend der Funktion von HSPC117 in Granula und der Konsequenzen des Knockouts im Gehirn werden dazu beisteuern die Rolle von HSPC117 in vivo aufzuklären.

Abstract

(Englisch)

Transfer RNAs (tRNAs) enable gene expression as they decode the mRNA and transport amino acids to the sites of protein synthesis. Some tRNAs need to be spliced as a process of maturation before they can actively participate in translation. After endonucleolytic cleavage and intron removal tRNA halves are joined by the tRNA ligase, which in humans forms a pentameric complex containing the five proteins HSPC117, the catalytically active subunit, DDX1, CGI-99, FAM98B and Ashwin. Besides the canonical tRNA splicing pathway, HSPC117, DDX1, CGI-99 and FAM98B were found in the cytoplasm of neurons, associated with RNA-protein aggregates. These RNA granules were reported to fulfill numerous functions such as transporting mRNAs to synapses to enable local translation, storing mRNAs during stress or regulating mRNA decay in so-called processing bodies. I hypothesized that in neurons the tRNA ligase complex might have a second function outside of the nucleus that differs from its role in nuclear tRNA splicing. To investigate this in more detail, I analyzed the subcellular localization of the tRNA ligase complex members. Immunostainings and immunoblotting of purified neurites surprisingly showed that not all of the proteins are localized to the same compartments. Moreover, upon stress, DDX1 and HSPC117 translocate to granular structures in the cytoplasm, indicating that localization of distinct tRNA complex members might be regulated in response to certain stimuli. To investigate the functional consequence of HSPC117 depletion in vivo, we created conditional knock-out mice lacking HSPC117 in neurons, i.e. HSPC117fl/fl Nestin Cre mice (Jennifer Jurkin, unpublished). These mice suffered from perinatal mortality and showed strong defects in specific brain structures. Isolated primary HSPC117fl/fl Nestin Cre neurons differed from neurons of control mice by accumulating FMRP-containing granules in the cytoplasm. Our results give a first hint on HSPC117 acting in the cytosol. Further studies concerning the function of HSPC117 in neuronal granules and the consequences of its depletion in the brain will hopefully elucidate the in vivo role of HSPC117 in neuronal development, function and survival.

Autor*innen

Therese Kaufmann

Haupttitel (Englisch)

The role of the tRNA ligase complex in neuronal RNA granules

Paralleltitel (Deutsch)

Die Rolle des tRNA Spleiß Komplexes in neuronal RNA Granula

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

81 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Javier Martinez

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC11358223

Utheses ID

24561

Studienkennzahl

UA | 066 | 877 | |

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