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The generation of short protein S1 variants during stress in Escherichia coli

Olga Ballauri

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Isabella Moll

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DOI

10.25365/thesis.27486

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29711.11147.759264-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Während Ihres Lebenszyklus sind Bakterien vielen schwierigen Bedingungen ausgesetzt. Einige Studien haben gezeigt, dass diese Bedingungen zusätzlich zur Aktivierung von sogenannten Toxin – Antitoxin(TA) Modulen führen können. Diese Module bestehen aus zwei transkriptional und translational gekoppelten Genen. Das erste TA Modul das in Escherichia coli beschrieben wurde, war das mazEF Modul. Es kodiert für das Toxin MazF und das Antitoxin MazE. Viele Studien haben gezeigt, dass das Toxin MazF eine Endoribonuklease ist, die die mRNA spezifisch an ACA Sequenzen schneidet. Dadurch wird die Mehrzahl der mRNAs degradiert. Zusätzlich kann diese Aktivität aber auch zur Bildung von sogenannten „leaderless mRNAs“ führen, da MazF hier direkt vor dem Startkodon schneidet und somit die 5´- untranslatierten Region und somit auch die Shine-Dalgarno-Sequenz entfernt. Da MazF zusätzlich das Ribosom modifiziert, kommt es zu einer selektiven Translation dieser „leaderless mRNAs“ und das translationale Program wird geändert. Eine Transkript, das durch MazF geschnitten wird, ist die rpsA mRNA, die für das ribosomale Protein S1 kodiert. In Escherichia coli und den meisten Gram-negativen Bakterien ist Protein S1 essenziell für die Translationsinitiation. Das Protein bindet an eine pyrmidinreichen Region in der 5‘- untranslatierten Region der mRNA in der Nähe der Ribosomenbindestelle und vermittelt dadurch die Ausbildung des Translationsinitiationskomplexes. Im Gegensatz dazu ist das Protein nicht essenziell für die Translation von „leaderless mRNAs“, die direkt mit einem AUG Startcodon beginnen. Wir konnten zeigen, dass die rpsA mRNA direkt vor dem AUG Startkodon durch MazF geschnitten wird. Zusätzlich haben wir einen weiteren Schnitt in der kodierenden Region beobachten. Da sich dieser zweite Schnitt direkt vor einem internen AUG Kodon im Leserahmen von rpsA befindet, liegt die Vermutung nahe, dass unter Stressbedingungen die Aktivierung des MazEF Systems zur Synthese einer verkürzten Variante des Proteins S1 kommt. Diesem 36,8 kDa Protein fehlt die N-terminale Domäne, die zur Bindung an das Ribosom essentiell ist. Da aber die RNA-bindenden Domänen vorhanden sind, könnte dieses verkürzte Protein eine signifikante, extraribosomale Rolle in der Regulation der Genexpression unter Stressbedingungen spielen. Das Ziel dieser Arbeit war daher diese Hypothese zu testen. Mithilfe von Überexpressionsstudien konnte ich zeigen, dass Protein S1MazF einen positiven Einfluss auf das Zellwachstum und die Proteinsynthese des E. coli Stammes Tuner hat. Somit könnte die Präsenz des S1MazF Proteins vorteilhalt für Zellen unter ungünstigen Bedingungen sein. Weiters konnte ich mithilfe von Mutationen an dem ACAUG Motiv, die einerseits den Schnitt durch MazF oder andereseits die Translation des kurzen S1 Proteins verhindern, feststellen, dass das Fehlen der Proteinvariante das Wachstum unter Stressbedingungen negativ beeinflußt. Zusammengefasst, weisen diese Resultate darauf hin dass, das Protein S1MazF eine wichtige Rolle für das Überleben unter Stressbedingungen und die nachfolgende Genesung der Zellen spielt.

Abstract

(Englisch)

During their lifetime bacteria are exposed to many stressful conditions, such as nutrient deprivation, changes in temperature or pH. It was shown that these stress conditions lead to activation of so-called toxin-antitoxin (TA) modules. These modules consist of two transcriptionally and translationally coupled genes, one encoding for a stable toxin and the other for a labile antitoxin. In Escherichia coli the first TA module that was described, was the mazEF module, consisting of the toxin MazF and the antitoxin MazE. It was shown, that MazF is an endoribonuclease that cleaves mRNA specifically at ACA sites, which besides degradation of bulk could result in formation of leaderless variants of specific transcripts, as it removes the 5’- UTR including the Shine and Dalgarno sequence. One target mRNA for this MazF activity is the rpsA transcript coding for the ribosomal protein S1. This protein is essential for translation initiation in E. coli and most Gram-negative bacteria as it mediates the binding of the 30S ribosomal subunit to the translation initiation site at the mRNA and thus facilitates the formation of the initiation complex by recognizing a pyrimidine-rich region within the 5’-untranslated region of the mRNA. On the contrary, protein S1 is dispensable for translation initiation of leaderless mRNAs which start directly with an AUG start codon. Employing primer extension analyses performed on the rpsA mRNA upon induction of mazF expression we were able to show that the mRNA is cleaved by the toxin at an ACA sequence located directly upstream of the AUG start codon. Moreover, these analyses indicated that MazF likewise cleaves at an internal ACAUG motif. Since this AUG codon is in frame with the rpsA gene it potentially can serve as start codon for the translation of a 5’-truncated leaderless mRNA that codes for a short S1 protein variant that lacks the N-terminal domains. This 36,8 kDa protein termed protein S1MazF could play a significant role in growth recovery of E. coli cells from stress conditions. To test for this assumption, I first studied the effect of protein S1 and S1MazF overexpression on cell growth and protein synthesis. Growth of E. coli strain Tuner harboring either plasmid pET-S1 (rpsA) or pET-S1MazF (rpsA*) was observed in LB and minimal medium respectively. The results showed that especially overexpression of S1MazF had stimulating effects on cell growth and thus the presence of the protein might be beneficial under adverse conditions. Moreover mutations introduced at the internal ACAUG sequence of the rpsA gene revealed that the lack of selective expression of S1MazF affects cell growth during recovery conditions. Taken together, my results indicate that the selective translation of S1MazF from the MazF generated rpsA mRNA contributes to the recovery of cells under non-permissive conditions.

Autor*innen

Olga Ballauri

Haupttitel (Englisch)

The generation of short protein S1 variants during stress in Escherichia coli

Paralleltitel (Deutsch)

Über die Synthese von verkürzten Varianten des Proteins S1 während Stress in Escherichia coli

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

57 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Isabella Moll

Klassifikation

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC10897828

Utheses ID

24571

Studienkennzahl

UA | 066 | 877 | |

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Schlagwörter