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Characterization of membrane lipids from virus-based vaccines using thin layer chromatography in combination with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
Manuel Hafner
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Günter Allmaier
DOI
10.25365/thesis.27575
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29294.47521.450063-6
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Impfstoffe stellen einen der größten Durchbrüche der medizinischen Geschichte dar. Eine große Vielfalt an Impfstoffen gegen eine ganze Armee an Krankheiten existiert heute, und hat gefährliche Krankheiten wie die Pocken heute nahezu ausgerottet. Von der synthetischen Herstellung von Antigenen über die Extraktion natürlicher Antigene bis hin zur biotechnologischen Produktion designter Antigene gibt es eine ganze Reihe an modernen Impfstoffherstellungsverfahren. Diese Vielfalt, einhergehend mit der Notwendigkeit einer einfachen Vergleichs- und Kontrollmethode unter den Verfahren zur besseren Erforschung und auch Zulassung, erfordert neue, moderne Analysenmethoden.
Die Mehrheit der vorkommenden Biomoleküle kann heute mit Massenspektrometrie untersucht werden. Ein großer Forschungsaufwand wurde in die Untersuchung der Infektionswege und Methoden von Viren getätigt (1-5), ohne jedoch einen für viele Viren wichtigen Bestandteil genauer zu untersuche; die virale Lipidmembran. Diese erste Anlaufstelle für des Angeborene und das Adaptive Immunsystem bei allen lipidumhüllten Viren schaffte es erst vor relativ kurzer Zeit größere Aufmerksamkeit auf sich zu ziehen, und das obwohl die Viruslipidmembran zu den komplexesten Systemen in der Welt der Organismen und Bioobjekten gehört. Vieles, vor allem hinsichtlich auf die genaue Rolle der Membran und ihrer Lipide auf Replikation, Invasion und Immunabwehr ist kaum bekannt und die meiste Forschung hier fand bisher mehrheitlich hinsichtlich des HIV Virus statt (2).
Das neugeborene Feld der „Lipidomik“, des jüngsten Zuwachses der „Omik“ Forschungsbereiche führte hier zu einem erneuerten Interesse in der Forschung rund um umhüllte Viren.
Aufgrund der recht geringen Probenmengen, des geringen Anteils den das Lipidom (massemäßig) am gesamten Virus oder Impfstoffpartikel ausmacht und der Ionensuppression durch prominente Bestandteile der Lipidmembran während der massenspektrometrischen Messung, wurde früh die Notwendigkeit einer vorgeschalteten Trennmethode ersichtlich. Diese Trenntechnik sollte Eigenschaften wie leichte Bedienung, hohe Reproduzierbarkeit und geringe Kosten in sich vereinen und MALDI-MS-kompatibel sein.
Diese Methode zur Trennung fand sich schnell in der standardmäßig in der Lipidchemie verwendeten Dünnschichtchromatographie, und dort wiederum in der optimierten Form der “High Performance” Dünnschichtchromatographie, im englischen abgekürzt als HPTLC.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Vor- und Nachteilen, den Möglichkeiten und den Stärken einer Lipidanalytikmethode basierend auf HPTLC mit „matrix assisted laser desorption ionization – time-of-flight mass spectrometry”, kurz MALDI-TOF Massenspektrometrie genannt. Ziel war es diese Strategie für die Untersuchung von Virusvakzinen zu entwickeln.
Im Laufe dieser Arbeit wurden optimal Konditionen gefunden um eine möglichst große Gesamtheit der Lipide einer Präparation mit der Methode von Bligh & Dyer zu extrahieren. Ein Vergleich weitverbreiteter Färbungsmethoden für Lipide wurde gemacht und mit Primulin ein universeller und sensitiver Farbstoff als geeignet für Vakzine und Synovialflüssigkeit gefunden. Trennmethoden basierend auf 1D und 2D HPTLC wurde evaluiert. Eine direkte Kopplung von HPTLC Platte mit MALDI-MS wurde erfolgreich getestet. Im Zuge von Imaging Massenspektrometrie direkt von 1D HPTLC konnte auch festgestellt werden, dass über die Trennung in Spots nach Lipidklassen hinaus eine zusätzliche Trennung der Lipidspezies innerhalb des jeweiligen Spots stattfindet.
Abstract
(Englisch)
Vaccines have been one of the major breakthroughs of medical history. A wide variety of viral vaccines exists today, combating most of viral infections ailing humanity, making some, like the pox, become extinct. From antigen synthesis over extraction of natural antigens from different sources to high tech methods like biotechnological production of engineered viral vaccines, type of vaccines and methods of vaccine production are very diverse. This diversity, along with the necessity of comparison and control methods requires a proven and reproducible, easy to use and accurate analytical method to evaluate vaccine properties.
Most prominent biomolecules of our time can be analyzed with mass spectrometry. A lot of research concerning virus action, reproduction and function has been done (1-5). Nevertheless viral membranes and therefore the first part of the virus or viral vaccine that contacts the innate and adaptive immune system, has only sparsely been analyzed. Especially since the lipid membrane is among the most complex system within the world of organisms and bio-objects, this is somewhat disappointing. Much, especially information concerning replication, invasion and immune defense is only sparsely understood and the extremely complex lipid composition of the membrane has only recently begun to gain attention and research activity so far focuses mainly on a few viruses such as HIV (2).
The emerging field of lipidomics, the newest addition to the family of “omics” has led to a renewed interest in virus features, this time focusing on the viral envelop, that a large percentage of viruses possess.
Due to the low concentration of lipids in virus extracts (mass-wise), and desorption/ionization suppression through prominent classes of lipids due to the ever present phosphatidylcholines with their quaternary positively charged ammonia group, the need for a pre-separation was clear early on. This pre-seperation technique should have qualities such as easy handling, high reproducibility, low cost and MALDI-MS compatibility.
This method of pre-separation is easily found in one of the standard methods of lipid analysis, 1D and 2D high performance thin layer chromatography (HPTLC).
This thesis evaluates the pros and cons, possibilities and strengths of a lipid analysis method based on HPTLC with „matrix assisted laser desorption ionization – time-of-flight mass spectrometry”, in short MALDI-TOF mass spectrometry. Aim of the work was to develop a strategy for analysis of viral vaccines.
In the course of this work optimal extraction conditions for maximum of extracted complete lipidome is found to be the extraction method of Bligh&Dyer. Comparison of widely used staining methods the staining with primuline dye was chosen, as well as separation conditions for 1D and 2D chromatography. Application of 2D HTPLC plates directly on a MS target with conductive tape was successfully tested and imaging of the HPTLC spots revealed that the spots have an additional separation within the spot according to their acyl side chain lengths.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Lipids mass spectrometry MALDI-TOF thin layer chromatography
Schlagwörter
(Deutsch)
Lipide Massenspektrometrie MALDI-TOF Dünnschichtchromatographie
Autor*innen
Manuel Hafner
Haupttitel (Englisch)
Characterization of membrane lipids from virus-based vaccines using thin layer chromatography in combination with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung von Membranlipiden von Virusimpfstoffen mittels Dünnschichtchromatographie gekoppelt mit Matrix unterstützter Laserionisierungs/desorbierungs Massenspektrometrie
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
90 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Günter Allmaier
Klassifikationen
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines ,
35 Chemie > 35.78 Lipide
AC Nummer
AC11418148
Utheses ID
24645
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |