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Plasmid free T7 based E. coli expression system
tandem gene integration
Marianne Schimon
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.2888
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29639.48472.644970-1
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Rekombinante Protein Produktion ist ein zentrales Element der modernen Biotechnologie und findet Anwendung in den verschiedensten industriellen Sparten. Viele neue therapeutische Zulassungen in der Pharmaindustrie werden mittels rekombinanter Proteinproduktion hergestellt. Niedrige Produktionskosten und stabile Prozesse werden von Seiten der Industrie gewünscht, was die Forschung und Entwicklung im Bereich der Prozessoptimierung vorantreibt. Plasmid codierte Expression von rekombinanten Genen unter starken Promotoren, wie dem T7 Promoter System, zählen zu den am häufigsten verwendeten Produktionssystemen in E. coli. Plasmidverlust oder Zusammenbruch des Produktionssystems durch Überbelastung des Wirtsmetabolismus sind nachteilige, aber akzeptierte Phänomene die durch das Fehlen von Alternativen zu erklären sind. Neue Konzepte, die auf der Integration des Produktgens in das Wirtschromosom basieren, können die bei Plasmidsystemen auftretenden Instabilitäten und auch die mit Plasmidreplikation und Expression der Begleitproteine verbundene Stoffwechselbelastung reduzieren. Eine stabile Prozessführung und höhere Produktausbeuten als bei Plasmidsystemen sprechen für eine Etablierung der chromosomalen Systeme als industrielle Produktionsprozesse. Jedoch existieren noch wenig Forschungsdaten und Produktionserfahrungen. Die Erforschung der Produktionskapazitäten eines genomintegrierten Expressionssystems und die Festlegung der metabolischen Belastungsgrenzen sind von besonderem Interesse und Wichtigkeit. Da die rekombinante Genexpression eines integrierten Gens den Wirtszellmetabolismus nicht vollständig auslastet, sollen im Zuge dieser Arbeit zwei idente Kopien des Produktgens ins Wirtschromosom integriert werden. Die Produktionsfähigkeit des Wirtsstamm sollte durch die Quantifizierung des produzierten Proteins ermittelt werden. Der Vergleich von Fermentationen des einfach genomintegrierten Stammes mit dem doppelt integrierten Stamm sollte mögliche Produktsteigerungen oder Prozesslimitierungen zeigen. Weiters stellt die Verfügbarkeit von genomintegrierten Systemen die Voraussetzung für die Erforschung der metabolischen Belastung verursacht durch Plasmidreplikation und Plasmid codierte Proteinexpression dar.
Abstract
(Englisch)
Cultivation of microorganisms for the production of recombinant proteins is of central importance for many industrial fields. Many pharmaceutical applications are based nowadays on recombinant protein production. Easy and cost-efficient processes are in high demand, offering a great research area for process optimization and new process development. E. coli production systems bearing a plasmid encoded heterologuous gene under a strong T7 expression promoter are widely distributed among industrial processes. Several phenomena encountered by T7 based plasmid systems, such as plasmid-loss during cultivation or break down of the system by metabolic overload, are unwelcome but accepted side-effects. Alternative expression systems are only sparsely available, giving plasmid based systems a predominant role in recombinant protein expression. New concepts based on the integration of the target gene into the host chromosome offer features, which diminish system instabilities encountered by plasmid systems. Stable processes and high production yields plead for the establishment of chromosomal systems in industrial applications. Because of few research data and lack of experience with the production capacities of such chromosomal based systems, investigations on product formation abilities and limitations of hosts bearing chromosomal-integrated recombinant genes are of distinct importance. Since recombinant gene expression by a single copy did not fully overstrain the host cell metabolism, two identical copies of the gene of interest should be inserted in this work. Comparisons of cultivation experiments between single and tandem integrated hosts, were performed to investigate the production capacity and limits of this system. In addition the availability of genome integrated systems provides the prerequisites to investigate the metabolic load due to plasmid replication and plasmid encoded protein expression.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
plasmid free expression systems T7 RNA polymerase recombinant protein production E. coli chromosomal integration systems tandem genes
Schlagwörter
(Deutsch)
plasmidfreie Expressionssysteme T7 RNA Polymerase rekombinante Proteinproduktion E. coli chromosomale Integrationssysteme Tandemgene
Autor*innen
Marianne Schimon
Haupttitel (Englisch)
Plasmid free T7 based E. coli expression system
Hauptuntertitel (Englisch)
tandem gene integration
Paralleltitel (Deutsch)
Plasmid freies T7 basierendes E. coli Expressionssystem: Integration von Tandemgenen
Paralleltitel (Englisch)
Plasmid free T7 based E. coli expression system: tandem gene integration
Publikationsjahr
2008
Umfangsangabe
78 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften ,
42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie
AC Nummer
AC07976145
Utheses ID
2513
Studienkennzahl
UA | 490 | | |