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Entwicklung alternativer Reinigungs- und Detektionsmethoden für den bispezifischen single-chain Antikörper r28M
Alfred Memaj
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Christoph Schüller
DOI
10.25365/thesis.28304
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29221.10256.480865-0
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der bispezifische single-chain-Antikörper r28M wurde für prospektive immuntherapeutischen Anwendung bei Patienten mit Melanom konzipiert. Der Antikörper wird im Plasma transgener Rinden produziert und ist in der Lage, humane T-Zellen über den CD28-Rezeptor, sowie Melanom-Zellen über das Membranprotein CSPG4 zu binden. Gleichzeitige Bindung beider führt zur Aktivierung der Immunzellen und weiter zum Abtöten der Tumorzellen.
Der rekombinanter scFv Antikörper r28M wird aus Rinderplasma gereinigt. Zu diesem Zweck können mehrere Strategien angewendet werden. Eine Möglichkeit ist die Verwendung von Protein L aus Peptostreptococcus magnus, das die Ig mancher Spezies über κ-Leichtketten bindet. Der r28M wurde am C-Terminus mit einem c-myc-Tag versehen. Ein monoklonaler α-c-myc-Antikörper (9E10) in Zellkultur hergestellt, aber auch kommerziell erhältlich, wurde in verschiedenen Arten eingesetzt. 9E10 bindet spezifisch an c-myc-Tag, was eine Alternative zur Reinigung und auch Detektion und Quantifizierung des r28M darstellt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung zwei verschiedenen Methoden, die auf der Bindung des c-myc-Tags basieren: eine Affinitätschromatographie für die Reinigung des r28M aus Rinderplasma sowie ein ELISA für die spezifische Detektion bzw. die Quantifizierung des r28M.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine α-c-myc-Affinitätsmatrix zur chromatographischen Reinigung des r28M entwickelt werden. Der 9E10 Antikörper wurde erfolgreich als Ligand an eine NHS-aktivierte Sepharose gekoppelt. r28M wurde dann via FPLC mittels α-c-myc Affinitätssäule gereinigt. Um den Einfluss der Pufferbedingungen auf die Affinitätsreinigung des rekombinanten Antikörpers zu testen, wurde das Rinderplasma mit verschiedenen Puffern verwendet. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen verschiedenen Bedingungen nachgewiesen werden.
Die Entwicklung des α-c-myc ELISA umfasste die Optimierung der Bedingungen für die Konzentrationsbestimmung des r28M im Plasma, sowie Durchführen mehreren Messungen über längere Zeiträume, um die Reproduzierbarkeit der ELISA-Ergebnisse zu testen. Die Messungen mittels kompetitivem α-c-myc ELISA Format wiesen eine signifikant bessere Reproduzierbarkeit auf, als die mittels Sandwich-Format ermittelten Konzentrationen. Der wesentliche Vorteil des kompetitiven gegenüber dem Sandwich ELISA ist die Verwendung des c-myc Peptids als unabhängigen Standard, dessen Konzentration bei -20 °C Lagerung stabil bleibt.
Weiters konnte in dieser Arbeit die Reproduzierbarkeit der entwickelten Assays getestet, sowie vergleichende Ergebnisse mit bisherigen Protein L dargestellt werden.
Autor*innen
Alfred Memaj
Haupttitel (Deutsch)
Entwicklung alternativer Reinigungs- und Detektionsmethoden für den bispezifischen single-chain Antikörper r28M
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
95 S.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Christoph Schüller
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11456835
Utheses ID
25275
Studienkennzahl
UA | 441 | | |