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Molecular identification and life cycle of the giant ectosymbiont of Eubostrichus dianaea
Nika Pende
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Jörg Ott
DOI
10.25365/thesis.28319
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29760.07615.983462-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In dieser Arbeit wurden die riesigen epibiotischen Bakterien (Eds), die auf dem marinen Nematoden E. dianaea leben, molekular identifiziert. Nach Klonierung und Sequenzierung
zeigte die phylogenetische Analyse der Eds 16S rRNA-Gene, dass Eds in eine Gruppe mit anderen Schwefel-oxidierenden Bakterien (SOB) fällt. Im Besonderen gehört Eds zum
MONTS Cluster, welches auch andere Eubostrichus-, Stilbonematid- und Oligochaetenassoziierte SOB beinhaltet. Mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte
gezeigt werden, dass die gefundenen SOB 16S rRNA-Gene aus der Gen-Bibliothek zu Eds gehören. Weiters zeigten FISH-Versuche von dissoziierten ektosymbiontischen Zellen, dass
nicht nur alle überdimensionalen filamentösen Bakterien auf der Nematodenkutikula, sondern auch die kleineren Bakterien, unabhängig von ihrer Größe und Morphologie, auch Eds sind. Die heterogene 16S rRNA Gen-Bibliothek enthielt auch Sequenzen von Schwefelreduzierenden Bakterien (SRB), die jedoch mit FISH zu keinem E. dianaea assoziierten Bakterium zugeteilt werden konnten. Die Diskrepanz zwischen der Heterogenität unserer 16S rRNA Gen-Bibliothek und der augenscheinlichen phylogenetischen Homogenität des
bakteriellen Mantels kann (1) dadurch erklärt werden, dass nicht-Eds Bakterien zu selten sind um sie mit FISH nachzuweisen und (2), dass nicht-Eds nicht unbedingt mit der Kutikula assoziiert sind, sondern auch mit anderen Körperregionen wie z.B.: dem Darm. Zusätzlich scheint Eds auf dem Nematoden zu wachsen, da auch kleine Zellen mit der Eds-Sonde ein Fluoreszenzsignal zeigten. Ein weiterer Anhaltspunkt dafür ist die Präsenz von multiplen Zellkernen (Polyploidie). In anderen Organismen wie Rhizobien wurde gezeigt, dass die Polyploidie durch Endoreduplikation entsteht. Diese wird durch den Wirt sekretierte Proteine induziert, was auch hier der Fall sein könnte. Weitere Anstrengungen zur
Erforschung von Nematod-sekretierten Peptiden und anderen Molekülen sollten angestellt werden, da diese möglicherweise die Cytokinese-Inhibierung/ Endoreduplikation vermitteln
könnten. Um auf die zweite Frage einzugehen, ob sich Eds teilen, wurde zuerst PCR mit FtsZspezifischen Primern mit genomische DNA von E. dianaea durchgeführt. Nachdem das Ftsz-Gen in der DNA nachgewiesen werden konnte, wurde die Expression dieses Gen mittels Western blot mit monoklonalen Maus Anti-Ftsz Antikörpern in Nematoden-extrakten getestet. Da das FtsZ-Gen exprimiert wird, haben wir Immunfluoreszenzuntersuchungen mit FtsZ-Antikörpern durchgeführt, um das Protein zu visualisieren und lokalisieren. Die Immunfluoreszenzuntersuchungen zeigten, dass sich Eds durch binäre Teilung vermehrt. Es konnten vier verschiedene Stadien des FtsZ-Signals gezeigt werden: (0) nicht nachweisbares Signal; (1) gepunktet, diffus; (2) gepunktet, konzentriert und (3) ringförmige Struktur in etwa in der Zellmitte. Nur ein kleiner Teil der filamentösen Bakterien scheinen sich zu teilen, in etwa 10% der Eds-Population. In nicht-teilenden Eds befanden sich multiple Nucleoide in der
Mitte der Zelle. In sich teilenden Filamenten war die DNA verdichtet und teilte sich in zwei bestimmte Zonen auf. Diese DNA-Verdichtung in getrennte Nucleoide könnte die DNA Segregation vor der Positionierung des FtsZ-Rings und der binären Teilung erleichtern. Immunfluoreszenzuntersuchungen mit MreB-Antikörpern zeigten eine diffuse und gepunktete Verteilung des MreB Proteins durchgehend in der ganzen Zellmembran der filamentösen Bakterien. Das weist daraufhin, dass die Zellwände von Eds gleichmäßig entlang ihrer Längsachse, und nicht polar, wachsen. Um einen näheren Einblick in die Zellteilung von Eds und die Positionierung des Z-Rings zu erhalten, sollten noch weiter Studien an anderen bei der Zellteilung beteiligten Proteinen durchgeführt werden.
Abstract
(Englisch)
The marine free-living nematode Eubostrichus dianaea (Stilbonematinae, Nematoda) carries giant filamentous bacteria on its cuticle, which form an ordered “fur” around its body.
Furthermore, at the base of the non-septated filaments, small rod-shaped bacteria could be detected. Using sequencing analysis and FISH we molecularly identified the giant and the
small ectosymbiotic cells as sulfur-oxidizing gammaproteobacteria. 16S rRNA-based phylogenetic analysis revealed that they belong to the Marine Oligochaete and Nematode Thiotrophic Symbionts (MONTS) cluster. In order to assess if (and how) the giant bacteria reproduce while attached to the host, we choose the well-studied tubulin homolog FtsZ as a marker for canonical cell division. Dividing rod-shaped Gammaproteobacteria usually place a constricting FtsZ ring at midcell, perpendicular to their long axis. Additionally, the actin homolog MreB directs peptidoglycan synthesis and may be used to visualize cell wall growth sites. We amplified the ftsZ-gene and showed that E. dianaea expresses both the FtsZ and MreB proteins by western blot analysis. Immunostaining revealed FtsZ polymerization into a
ring at mid-cell, together with a dotted but homogenously distributed MreB localization pattern in all stages. DAPI stainings showed that each giant cell is polyploidy with up to 16 nucleoids. This is the first report of a over 100 μm-long Gammaproteobacterium which – after homogenous growth throughout its length and equal segregation of multiple nucleoids – places a FtsZ ring at mid-site (transverse binary fission).
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Symbiosis marine nematode sulfur-oxidizing bacteria cell division multiple nucleoids
Schlagwörter
(Deutsch)
Symbiose mariner Nematode Schwefel-oxidierende Bakterien Zellteilung multiple Nucleoide
Autor*innen
Nika Pende
Haupttitel (Englisch)
Molecular identification and life cycle of the giant ectosymbiont of Eubostrichus dianaea
Paralleltitel (Deutsch)
Molekulare Identifizierung und Lebenszyklus des rießigen Ektosymbionten von Eubostrichus dianaea
Paralleltitel (Englisch)
Molecular identification and life cycle of the giant ectosymbiont of Eubostrichus dianaea
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
53 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Jörg Ott
Klassifikation
42 Biologie > 42.94 Meeresbiologie
AC Nummer
AC11051822
Utheses ID
25287
Studienkennzahl
UA | 444 | | |