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Investigations on murine colitis-associated bacteria

a quantitative PCR and microscopy approach

Ina Maria Rennisch

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Christa Schleper

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DOI

10.25365/thesis.28368

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29105.30341.934663-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Gesundheit des Menschen und insbesondere die des Verdauungsapparats ist abhängig von der Aktivität von Mikroorganismen. Die ständige Anwesenheit einer Vielzahl von Bakterien in unserem Körper erfordert ein sensibles Gleichgewicht zwischen der Aktivität des Immunsystems und der Mikrobiota. Leidet man an einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung wie Morbus Crohn oder Colitis Ulcerosa ist dieses Gleichgewicht gestört. Bis heute sind die Auslöser für diese beiden Krankheiten nicht bekannt. Daher ist die Suche nach verlässlichen diagnostischen Markern Gegenstand reger Forschung. Im Rahmen eines Kooperationsprojektes (InflammoBiota) wurden Indizien gefunden, dass das Bakterium Akkermansia, beziehungsweise die Flagelline der Clostridien Indikatoren für Darmentzündungen sein könnten. Das Ziel dieser Studie war daher, zu überprüfen, ob Akkermansia und die Flagelline der Clostridien tatsächlich geeignete Indikatoren für akute Darmentzündungen sind. Dafür wurde ein Mausmodell verwendet, bei dem die Entzündung durch die Verabreichung von Dextran-Natriumsulfat hervorgerufen wird. Veränderungen in der Abundanz von bakteriellen Gruppen und der Expression ausgewählter Gene wurden mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) anhand von Proben aus dem Darmlumen untersucht, die während akuter Entzündung, ihrer Entstehung und der Genesung genommen worden waren. Zusätzlich zu der 16S rRNA von Akkermansia wurden noch drei seiner funktionellen Gene (Rubrerythrin, β-N-Acetylhexosaminidase und kapsulare Exopolysaccharidsynthese) untersucht. Um die Flagellen außerdem zu visualisieren wurden verschiedene Mikroskopieansätze verwendet, darunter Immunofluoreszenz (IF). Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an Akkermansia 16S rRNA Genen während der akuten Darmentzündung bis zu 20.000 fach anstieg und negativ mit dem Körpergewicht der Mäuse korrelierte. Die Ursache für den Anstieg von Akkermansia könnte die Ablösung von Mukus vom Darmepithel sein. Dadurch würde die Nährstoffzugänglichkeit für Akkermansia Zellen erhöht, welche Mukus als alleinige Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle nutzen. Außerdem deutete der Anstieg von Transkripten des Rubrerythrins, welches Schutz vor oxidativem Stress bietet, auf eine durch Sauerstoff ausgelöste Stressreaktion von Akkermansia bei akuter Darmentzündung hin. Die Abundanz der Clostridienflagelline war während der akuten Darmentzündung reduziert. Da die Durchlässigkeit des Darmepithels während der Entzündung erhöht ist, könnte dies zu einer erhöhten Aktivierung des Immunsystems durch das starke Flagellinantigen geführt haben. Eine Methode zur Kombination von IF und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurde etabliert, wodurch die Flagellen spezifischen Bakterien zugeordnet werden konnten. Die Ergebnisse von IF-FISH und qPCR waren konsistent. Zur Bestätigung der Kompatibilität dieser Methoden sollten jedoch noch weitere Studien mit mehreren Proben durchgeführt werden. Insgesamt konnte bestätigt werden, dass Akkermansia und die Flagelline der Clostridien als Indikatoren für akute Darmentzündungen bei Mäusen dienen können. Zukünftige Studien werden zeigen, ob diese Resultate auf Darmentzündungen des Menschens übertragbar sind.

Abstract

(Englisch)

Human health and in particular our digestive system is dependent on the activity of many microorganisms. The continuous presence of high amounts of bacteria in our body demands a delicate homeostasis between the activity of the immune system and the microbiota. In patients suffering from inflammatory bowel disease (IBD) like Crohn’s disease (CD) or ulcerative colitis (UC) this homeostasis is disrupted. Until today, the causes of IBD are not known. Therefore, the search for reliable diagnostic markers represents an area of active research. Based on previous results obtained in the frame of a collaborative project (InflammoBiota), it was hypothesized that the bacterium Akkermansia and clostridial flagellins are indicators for inflammation. The aim of this study was to verify whether Akkermansia and clostridial flagellins may indeed represent suitable indicators for acute colitis. For this purpose, a mouse model using dextran sodium sulfate (DSS) to induce inflammation was utilized. To examine shifts in the microbiota composition and in the expression of selected genes, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed on samples derived from luminal content during acute inflammation, development and recovery. In addition to Akkermansia 16S rRNA, three of its functional genes (rubrerythrin, β-N-acetylhexosaminidase and capsular exopolysaccharide synthesis) were investigated. In order to visualize flagella, different microscopy approaches, including immunofluorescence (IF), were used. It was shown that the 16S rRNA gene abundance of Akkermansia increased up to 20,000 fold in acute murine colitis and was negatively correlated to the body weight of the mice. The reason for the increase of Akkermansia might have been the mucus detachment from the epithelium which leads to a better accessibility of nutrients for Akkermansia, as the organism uses mucin as sole carbon, nitrogen and energy source. Also, the increase of transcripts for rubrerythrin, which is involved in oxidative stress protection, indicated an oxygen directed response of Akkermansia to the inflammation during acute colitis. The abundance of clostridial flagellins decreased during acute inflammation. As the permeability of the epithelium increases during inflammation, this might have led to an increased exposure of the strong flagellin antigen to the immune system which in turn triggered an increased antibacterial activity targeting (flagellated) bacteria. A method combining IF and fluorescence in situ hybridization (FISH) was successfully established. This allowed the assignment of flagella to specific bacterial orders. The results obtained by IF-FISH and qPCR were similar. However, for confirmation of the comparability of these two methods, further investigations using more samples will be required. In conclusion, it was verified that Akkermansia and the clostridial flagellins are indicators of acute murine colitis. Future studies will show whether these findings can be validated in human colitis.

Autor*innen

Ina Maria Rennisch

Haupttitel (Englisch)

Investigations on murine colitis-associated bacteria

Hauptuntertitel (Englisch)

a quantitative PCR and microscopy approach

Paralleltitel (Deutsch)

Untersuchungen von Bakterien, die mit Kolitis von Mäusen in Verbindung stehen: anhand quantitativer PCR und Mikroskopie

Paralleltitel (Englisch)

Investigations on murine colitis-associated bacteria: a quantitative PCR and microscopy approach

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

111 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christa Schleper

Klassifikation

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC11051867

Utheses ID

25327

Studienkennzahl

UA | 444 | | |

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