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Purification of the cytokine CXCL5 via immuno-precipitation and quantification from different matrices applying NanoUHPLC-ESI-Orbitrap
Rupert Mayer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Christopher Gerner
DOI
10.25365/thesis.28497
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29101.77052.560265-6
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Für die Quantifizierung von Biomarkermolekülen aus komplexen biologischen Proben stellen ELISA und andere immunologische Methoden zurzeit die Methode der Wahl in der klinischen Anwendung dar. Die Vorteile von ELISA gegenüber anderen nicht Antikörper-basierenden Methoden sind sowohl die hohe Sensitivität der Antikörper als auch die einfache Anwendung der Methode ohne die Notwendigkeit teurer oder wartungsintensiver Instrumente. Andererseits zeigen viele dieser Methoden eine große Anfälligkeit gegenüber Matrixeffekten, wodurch es zu verminderter Genauigkeit und eingeschränktem dynamischem Bereich der Analyse kommen kann. Hieraus ergibt sich ein verstärktes Interesse an anderen Methoden zur Biomarkerbestimmung, welche stabiler gegenüber Matrixeinflüssen wie beispielsweise die Massen-spektrometrie. Trotz der außerordentlichen technologischen Fortschritte, die auf dem Gebiet der Massen-spektrometrie in den letzten Jahrzehnten erzielt werden konnten, überfordert der riesige dynamischen Bereich potentieller Analyten, der in klinisch relevanten Proben, wie Blutserum, zu finden ist, nach wie vor selbst high-end MS Instrumente. Angesichts dessen muss die Probenkomplexizität durch effiziente Frak-tionierungsschritte oder Auftrennungsschritte bereits vor der Messung im Massenspektrometer reduziert werden. Am Beispiel von Cytoplasmaproben von Jurkatzellen wurde eine effiziente Trennmethodik, be-stehend aus einem Proteinfraktionierungsschritt mittels Elektrophorese und einem Peptidauftrennungs-schritt mittels Chromatographie, optimiert. Um den klinisch interessanten pg/mL Konzentrationsbereich analytisch zu erfassen, wurde zusätzlich ein Immunpräzipitationsschritt zur spezifischen Anreicherung eines ausgewählten kleinen, niedrige-abundanten Proteins durchgeführt. Als Beispiel für ein solches Pro-tein wurde das Cytokin CXCL5 ausgewählt. Obwohl deutlich höherer Signalintensitäten für CXCL5 erzielt werden konnten, wenn die obig beschriebene Trennmethodik um die selektive Immunpräzipitation erwei-tert wurde konnte eine untere Nachweisgrenze von 1 ng/mL nicht unterschritten werden.
Abstract
(Englisch)
For the quantification of biomarker molecules from complex biological samples ELISA and other immuno-logical methods are currently the golden standard in clinical practice. The advantages of ELISA in com-parison to other non-immunological quantification methods are its high sensitivity and the ease of imple-mentation without the need of expensive and maintenance-intensive instrumentation. On the other hand, many ELISAs may be quite sensitive to matrix effects and exhibit only limited linear range and accuracy in complex samples. Therefore other detection methods with less matrix sensitivity like mass spectrome-try-based methods are of increasing interest for biomarker quantification. In spite of the tremendous tech-nological progress mass spectrometry has experienced in the last few decades, the dynamic range of potential analytes in clinically relevant samples like blood serum are still overpowering the capabilities of even high-end mass spectrometers. This implicates the need for efficient sample prefractionation in com-bination with high performance liquid chromatography in order to reduce sample complexity. On the basis of cytoplasm samples from Jurkat cells, an efficient separation workflow combining protein separation by electrophoresis with peptide separation by chromatography was optimized. In order to assess the clinical-ly relevant pg/mL range, an additional step of immunoprecipitation was applied for a small low abundant protein. As an example for such a protein the biologically interesting cytokine CXCL5 was chosen as analyte. Although significantly higher signal intensities were achieved for CXCL5 using our separation strate-gies in combination with the immunoprecipitation step, the lower limit of detection could not be improved below 1 ng/mL.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Quantitative mass spectrometry immunoprecipitation cytokine CXCL5 complex matrix
Schlagwörter
(Deutsch)
Quantitative Massenspektrometrie Immunpräzipitation Cytokin CXCL5 komplexe Matrix
Autor*innen
Rupert Mayer
Haupttitel (Englisch)
Purification of the cytokine CXCL5 via immuno-precipitation and quantification from different matrices applying NanoUHPLC-ESI-Orbitrap
Paralleltitel (Deutsch)
Aufreinigung des Cytokins CXCL5 mittels Immunpräzipitation und Quantifizierung aus unterschiedlichen Matrices mittels NanoUHPLC-ESI-Orbitrap
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
96 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christopher Gerner
AC Nummer
AC11576275
Utheses ID
25445
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |