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Onset and maintenance of Airn non-coding RNA mediated imprinted expression in an in vitro embryonic stem cell model
Federica Santoro
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Denise Barlow
DOI
10.25365/thesis.28525
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29553.22631.744759-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Genomische Prägung ist ein epigenetisches Phänomen, welches die Expression bestimmter Gene in Säugetieren von nur einem der beiden elterlichen Allele darstellt. Geprägte Gene treten meistens in Clustern auf welche sowohl protein-kodierende als auch lange nicht-kodierende RNA (lnkRNA) Gene beinhalten. In dem geprägten Igf2r Cluster der Maus bewirkt die väterlich exprimierten lnkRNA Airn das Stilllegen von Igf2r am selben Chromosom, dem eine Anreicherung von DNA Methylierung am unterdrückten Igf2r Promoter folgt. Es ist jedoch weder bekannt ob Airn oder die DNA Methylierung die genomische Prägung von Igf2r bewirkt noch ob die stilllegende Funktion von Airn an ein Zeitfenster während der Entwicklung gebunden ist. Für meine Untersuchungen habe ich embryonale Stammzellen (ESZ) verwendet, da während deren Differenzierung der Beginn der genomischen Prägung von Airn und Igf2r nachvollzogen werden kann. Durch gezielte Genmodifikationen habe ich zwei induzierbare Systeme entwickelt, mit denen ich die Transkription von Airn während der ESZ Differenzierung an- und abschalten kann. Die erste Zelllinie beinhaltet zwei loxP-Stellen die den Promoter von Airn flankieren. Durch Verwendung einer Tamoxifen induzierbaren CreER Rekombinase kann die Promotersequenz entfernt und die Transkription von Airn während der ESZ Differenzierung abgeschaltet werden. Mit dieser Methode konnte ich zeigen, dass die kontinuierliche Transkription von Airn notwendig ist um die Stilllegung von Igf2r beizubehalten, jedoch nur bis der väterliche Igf2r Promoter DNA methyliert wird. Weiters konnte ich beobachten, dass diese Methylierung unabhängig von Airn am Promoter erhalten bleibt. Die zweite Zelllinie exprimiert eine verkürzte, nicht funktionelle Form von Airn, wobei das Abbruchsignal wiederum von zwei loxP-Stellen flankiert wird. In diesem Fall wird durch CreER die durchgehende, funktionsfähige Form von Airn während der ESZ Differenzierung wiederhergestellt. Mit diesen Zellen konnte ich zeigen, dass die unterdrückende Aktivität von Airn gegenüber Igf2r an keinerlei Zeitfenster während der Differenzierung gebunden ist. Außerdem konnte ich beobachten, dass die Stilllegung von Igf2r ohne DNA Methylierung auftreten kann. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse meiner Arbeit, dass während ESZ Differenzierung die lnkRNA Airn unerlässlich aber auch ausreichend für die Stilllegung von Igf2r ist. Darüberhinaus repräsentiert DNA Methylierung eine zusätzliche epigenetische Ebene um die Unterdrückung von Igf2r zu gewährleisten.
Abstract
(Englisch)
Genomic imprinting is an epigenetic phenomenon controlling parental-specific monoallelic expression of some mammalian genes. Imprinted genes generally occur in clusters, containing both protein-coding and long non-coding RNA (lncRNA) genes. In the mouse imprinted Igf2r cluster, expression of the Airn lncRNA is necessary to initiate paternal-specific silencing of Igf2r, followed by gain of DNA methylation on the repressed Igf2r promoter. However, it is unknown if Airn and DNA methylation are necessary to maintain stable Igf2r repression or if the repressive effects of Airn are confined to a developmental ‘window of opportunity’. Here, I used an embryonic stem (ES) cell differentiation system that mimics the developmental onset of Igf2r and Airn imprinted expression and gene targeting technology, to establish two inducible systems to turn Airn on or off during ES cell differentiation. First, I created an ES cell line in which loxP sites flank the Airn promoter. I then used the tamoxifen-inducible CreER recombinase to delete the promoter, turning Airn transcription off, during ES cell differentiation. By using this tool, I was able to show that continuous Airn expression is needed to maintain Igf2r silencing, but only until the paternal Igf2r promoter gains DNA methylation. I could also show that this methylation mark is maintained independently of the Airn lncRNA. Next, I established an ES cell line expressing a truncated, non-functional form of Airn in which loxP sites flank the truncation signal. In this case, activating CreER restores full-length Airn transcription during differentiation. With this tool, I showed that the silencing activity of Airn is not limited to a developmental ‘window of opportunity’, as Airn can silence Igf2r in both early and late differentiated ES cells. Moreover, I observed that Igf2r repression could be maintained in the absence of DNA methylation. Together, the results presented in this thesis show that the Airn lncRNA is both necessary and sufficient to silence Igf2r throughout ES cell differentiation and that DNA methylation probably adds an extra layer of epigenetic information to safeguard the silent Igf2r allele.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
long non-coding RNA Airn Igf2r genomic imprinting embryonic stem cells DNA methylation epigenetic silencing
Schlagwörter
(Deutsch)
lange nicht-kodierende RNA Airn Igf2r genomische Prägung embryonale Stammzellen DNA Methylierung epigenetisches Stilllegen
Autor*innen
Federica Santoro
Haupttitel (Englisch)
Onset and maintenance of Airn non-coding RNA mediated imprinted expression in an in vitro embryonic stem cell model
Paralleltitel (Deutsch)
Beginn und Aufrechterhaltung der genomischen Prägung durch die nicht-kodierende RNA Airn in einem in vitro embryonalen Stammzellmodell
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
127 S., [18] Bl. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anton Wutz ,
Meinrad Busslinger
AC Nummer
AC11328265
Utheses ID
25466
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |