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Metabolite studies in-vitro and in-vivo
from preclinical evaluation to clinical trials
Lukas Nics
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Karl-Heinz Wagner
DOI
10.25365/thesis.28647
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29822.12658.244461-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die vorliegende Dissertation hat sich mit verschiedenen Aspekten des Metabolismus von Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Tracern beschäftigt. Die genaue Bestimmung der jeweils aktuellen Verhältnisse von intaktem und metabolisiertem Tracer ist eine Voraussetzung für eine sichere Anwendung und in weiterer Folge der Quantifizierung dieser Moleküle im lebenden Organismus.
Für einen großen Teil der Dissertation diente [18F]FE@SUPPY (5-(2-[18F] fluoroethyl)2,4-diethyl-3-(ethylsulfanylcarbonyl)-6-phenylpyridine-5-carboxylate) als Modellsubstanz. Aber auch [11C]Me@APPI (1-(3-([11C]methyl amino)-1-phenylpropyl)-3-phenyl-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-one), [18F]FE@SNAP (2-[18F]fluoroethyl3-((3-(4-(3-acetamidophenyl)piperidin-1-yl) propyl)carbamoyl)-4-(3,4-difluorophenyl)-6-(methoxymethyl)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate) und [carbonyl-11C]WAY100635 (N-(2-(4-(2-methoxyphenyl) piperazin-1-yl)ethyl)-N-(pyridin-2-yl)-cyclohexane[11C]carboxamide) dienten als Substrate für die Evaluierung der metabolischen Eigenschaften sowohl in-vitro als auch in-vivo.
Die Dissertation gliedert sich folgendermaßen:
1) Einzelenzym-Experimente mit Carboxylesterasen;
2) Multienzym-Experimente mit Lebermikrosomen, welche den Komplex Cytochrom P-450 enthalten sowie mit gepooltem Plasma;
3) Experimente, um das Passieren von Radiotracern über die Blut-Hirn-Schranke vorherzusagen; und
4) in-vivo Metabolismus Experimente im Zuge einer klinischen PET-Studie
ad 1) Alle evaluierten Forschungstracer haben innerhalb des Moleküls entweder Ester- oder Amidbindungen. Die Spaltung dieser Bindungen über das Enzym Carboxylesterase gehört zu den frühen metabolischen Einflüssen. Deshalb liefert uns auch eine Kinetik (Michaelis-Menten-Kinetik) dieser in-vitro stattfindenden Spaltung erste Informationen über eine Stabilität der Tracer – mit dem Hintergrund, dass Esterasen für einen Großteil der Ester- und Amidspaltung verantwortlich sind.
ad 2) Als weiterer Schritt für eine breitere Anwendbarkeit und für einen höheren Grad an Vorhersagbarkeit im Vergleich zu „Einzelenzym-Daten“ eignet sich die Anwendung des „kompletten Enzym-Apparates“ für die Erstellung einer Kinetik. Sowohl Lebermikrosomen als auch Plasma (beides aus Mensch und Ratte) wurden unter physiologischen Bedingungen mit unseren PET-Tracern inkubiert um ein metabolisches Profil zu erhalten. Die Analysen wurden mit der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) durchgeführt.
ad 3) Zusätzlich zum metabolischen in-vitro Verhalten der PET-Tracer ist es von entscheidender Wichtigkeit, Informationen über ein mögliches Passieren der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu gewinnen. C18-HPLC Methoden werden verwendet, um den Verteilungskoeffizienten (log P) zu erhalten. Dieser logP-Wert ist ein physikalischer Parameter des Tracers und dient der Abschätzung, ob das Molekül die BHS passieren könnte. Da der LogP eine sehr unspezifische physikalische Größe ist, wurde eine HPLC-Chromatographie mit immobilisierten künstlichen Membranen (IAM) eingesetzt, um genauere Informationen über Substrat-Membran-Interaktionen des Tracers zu bekommen. Diese Methode erlaubt auch, dessen Stoffverteilung zwischen wässriger Phase und Membran zu berechnen. Dieser systematische Ansatz ist nur für Moleküle zulässig, deren Hauptmechanismus für das Passieren der BHS die passive Diffusion durch Zellmembranen darstellt.
ad 4) Wenn das in-vitro Verhalten der verwendeten Moleküle bekannt ist, folgt der finale Schritt: die Evaluierung der Situation in-vivo. Im Zusammenhang mit einer klinischen Studie war es von entscheidender Wichtigkeit, eine schnelle und zuverlässige HPLC Methode zu entwickeln, um die Abbaurate des Tracers in Menschen messen zu können. Zu bestimmten Zeitunkten wurde den Probanden Blut entnommen und aus diesem die Metaboliten bestimmt. Die Quantifizierung wurde mittels Radio-HPLC durchgeführt.
Die Haupt-Fragestellung dieser Dissertation ist die Implementierung einer Reihe verschiedener enzymatischer Methoden (in-vitro und in-vivo) unter der Verwendung von Humanmaterial (sowohl Enzyme als auch Blut), um das Wissen über das metabolische Verhalten unserer PET-Forschungstracer zu steigern. Dadurch soll tieferes Verständnis sowie eine gewisse Vorhersagbarkeit erreicht werden, wodurch die Weiterentwicklung der Tracer leichter lenkbar wird. Die entwickelten und optimierten Methoden werden nunmehr bei der Evaluierung neuer Liganden standardmäßig Anwendung finden.
Abstract
(Englisch)
The present thesis deals with several aspects of the metabolism of tracers for Positron-Emission-Tomography (PET). The exact determination of the current ratio of intact and metabolized tracer is a prerequisite for a further quantification and safe application of these molecules in living organisms.
As a model substrate, a major part of this thesis dealt with [18F]FE@SUPPY (5-(2-[18F]fluoroethyl) 2,4-diethyl-3-(ethylsulfanylcarbonyl)-6-phenylpyridine-5-carboxylate). Furthermore, the ligands [11C]Me@APPI (1-(3-([11C]methylamino)-1-phenylpropyl)-3-phenyl-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-one), [18F]FE@SNAP (2-[18F]fluoroethyl 3-((3-(4-(3-acetamido phenyl) piperidin-1-yl)propyl)carbamoyl)-4-(3,4-difluorophenyl)-6-(methoxymethyl)-2-oxo-1, 2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate) and [carbonyl-11C]WAY100635 (N-(2-(4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)ethyl)-N-(pyridin-2-yl)-cyclohexane[11C]carboxamide) served as substrates to evaluate their metabolic behaviour using in-vitro as well as in-vivo methods.
This thesis is divided in 4 sub-sections:
1) Single enzyme experiments using carboxylesterase;
2) Multi-enzyme experiments using hepatic liver microsomes containing Cytochrom P-450 as well as metabolic experiments using pooled plasma;
3) Experiments to assess the penetration of radiotracers of the blood-brain-barrier; and
4) in-vivo metabolite quantification in a clinical study
ad 1) All of the evaluated research PET-tracers carry ester or amide moieties. The cleavage of these functions via carboxylesterase belongs to the first line of metabolism. Thus, the Michaelis-Menten kinetics of the enzymatic decomposition in-vitro gives a first estimate for the in-vivo stability of the tracer (bearing in mind, that esterases are responsible for the major part of metabolism of esters and amides in-vivo). The different metabolites have been analyzed by dedicated high-pressure-liquid chromatography (HPLC) methods.
ad 2) As a further step towards a wider applicability and a higher degree of predictability of our “single-enzyme data”, the next logical step was the application of “almost the entire” enzymatic apparatus for metabolic degradation. Hepatic microsomes and plasma from human and rat origins were prepared under standard conditions and our PET-tracers were subjected to enzymatic treatment. The metabolites were analyzed by HPLC methods.
ad 3) Additionally to the metabolic behaviour of PET-tracers in-vitro, information and prediction of the penetration of the blood brain barrier (BBB) is of high interest. C18-HPLC methods were used to obtain the partition coefficient (log P), a measure for lipophilicity of the compound of choice, giving an indication if a tracer is able to pass the BBB. Immobilized artificial membrane (IAM) chromatography (specific HPLC columns are commercially available) is a new method to provide information on compound-membrane-interactions and represents the solute distribution between the aqueous phase and the membrane. This is a systemic approach for molecules which main mechanism of transport across cell membranes is passive diffusion.
ad 4) Having information on the in-vitro behaviour of the molecules is followed by the evaluation of the in-vivo behaviour. As part of a clinical study, it was of particular importance to develop a fast and reliable HPLC method to determine the extent and velocity of the metabolic process of a radiotracer which was administered to humans. After defined time points, the metabolites were extracted from blood and quantified by radio-HPLC.
The main focus of this thesis is the implementation of various enzymatic methods (in-vitro and in-vivo) using human tissues (enzymes and blood) to enhance the knowledge on the metabolic behaviour of investigated PET-tracers. Thus, predictions to a certain extent should be enabled. The introduced and optimized methods will become standard procedures in the development of new PET-radiotracers to assess their metabolic status.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
metabolism carboxylesterase cytochrome P450 plasma blood-brain barrier preclinic in-vitro in-vivo PET
Schlagwörter
(Deutsch)
Metabolismus Carboxylesterase Cytochrom P450 Plasma Bluthirnschranke Präklinik in-vitro in-vivo PET
Autor*innen
Lukas Nics
Haupttitel (Englisch)
Metabolite studies in-vitro and in-vivo
Hauptuntertitel (Englisch)
from preclinical evaluation to clinical trials
Paralleltitel (Englisch)
Metabolite studies in-vitro and in-vivo: From preclinical evaluation to clinical trials
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
186 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Pius August Schubiger ,
Gerald Reischl
AC Nummer
AC10898097
Utheses ID
25576
Studienkennzahl
UA | 091 | 474 | |