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Establishment of reporter cell lines for the characterization of Brachyury and Mesp1 expression during in vitro cardiomyogenesis
Lucia Maria Leitner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Georg Weitzer
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.28655
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29115.12203.817854-8
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Erkrankungen des Herzens sind immer noch eine der Haupttodesursachen weltweit. Da das Herz ein sehr geringes regeneratives Potential hat, eröffnet die Existenz von somatischen Herzstammzellen neue Möglichkeiten, wie man mit Erkankung und Alterung umgehen kann. Um den Signaltransduktionsweg von Wnt und das Expressionsverhalten von Brachyury und Mesp1 während der in vitro Differenzierung zu charakterisieren, wurde eine embryonale Stammzelllinie (ESZ) und eine kardiovaskuläre Vorläuferzelllinie (KVZ) mit Reporter Plasmiden (pT-Brap-Puro-IRES2-EGFP, pMesP1-EGFP and M50 Super 8x TOPFlash) stabil transfiziert. Brachyury ist einer der besten Marker für das frühe Pan-Mesoderm. Dessen transiente Expression findet man im gesamten enstehendem Mesoderm und wird herunterreguliert, sobald die mesodermalen Zellen sich zu differenzieren beginnen. Mesp1 ist ein bHLH Transkriptionsfaktor, der spezifisch in den meisten kardiovaskuläre Vorläufern exprimiert wird, und der für die Entstehung des Herzens notwendig ist. Mesp1 scheint eine Schlüsselrolle in frühen Zeitpunkten der Herzentstehung zu spielen und ist ein vielversprechender Transkriptionsfaktor um weitere direkt beeinflusste Zielgene zu identifizieren. Man weiß, dass der Wnt Signaltransduktionsweg die Entstehung des Mesoderms induziert. Seine Aktivierung ist nur vorübergehend und sowohl zeitlich wie auch räumlich reguliert. Wnt ist ein bekannter Aktivator von Brachyury; sein direkter Einfluss auf Mesp1 ist noch nicht nachgewiesen. Das in vitro Model “Embryoid Bodies” (EBs) wurde verwendet um die Expression von Brachyury, Mesp1 und dem Wnt Signaltransduktionsweg während der frühen Embryogenese zu untersuchen, in “Cardiac Bodies” (CBs) wird die Expression während der Kardiomyogenese widergespiegelt. Die ExpressionsWerte wurden entweder mittels durchflusszytometrischen Analysen (Brachyury und Mesp1), oder mittels Luminiszenz (Wnt Signaltransduktionsweg) evaluiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass das Erhöht Grün Fluoreszierende Protein (EGFP), welches von den Promotoren von Brachyury und Mesp1 angeschaltet wurde, am fünften Tag der ESZ Differenzierung transient hochreguliert wurde; zusätzlich konnten wir zeigen, dass die aus KVZ entstandenen CBs fünf Tage in der Entwicklung voraus sind, da das EGFP, angeschalten sowohl vom Brachyury Promoter als auch vom Mesp1 Promoter, nur am Beginn der Differenzierung gefunden wurde, und danach abgeschaltet wurde. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die TOPflash Reporter Zelllinie Wnt Signal entsprechend reagierte. Diese Ergebnisse ermöglichten uns den Einfluss eines GSK-Inhibitors (CHIR) und eines TGF-β Inhibitors (SB 431542) auf die Expression der Reportergene zu zeigen. Diese experimentellen Daten fördern das Verständnis des transkriptionellen Netzwerkes, welches die Herzentstehung reguliert und wird zur Verbesserung von Strategien beitragen, wie man somatische Stammzellen effizient in funktionale Herzmuskelzellen differenzieren kann.
Abstract
(Englisch)
Heart conditions are still one of the leading causes of death worldwide. As the heart has a very low regenerative potential, the existence of somatic cardiac stem cells opens new perspectives on how to deal with disease and aging. In order to characterize the Wnt signaling pathway and the expression pattern of Brachyury and Mesp1 during in vitro differentiation we have stably transfected an embryonic stem cell (ESC) line and a cardiovascular progenitor cell (CVPC) line with reporter plasmids (pT-Brap-Puro-IRES2-EGFP, pMesP1-EGFP and M50 Super 8x TOPFlash). Brachyury is one of the best markers of early pan-mesoderm. Its transient expression is found in all nascent mesoderm and is down-regulated as these cells undergo specification. Mesp1 is a bHLH transcription factor, which is expressed specifically in almost all cardiovascular precursors and is required for cardiac morphogenesis. Mesp1 seems to play a key role during earliest time points of cardiovascular determination and is a promising transcription factor to identify additional direct target genes. Wnt signaling pathway is known to induce the formation of mesoderm. Its activation is only transient and it is spatially and temporally regulated. Wnt is a known activator of Brachyury; its direct influence on Mesp1 is not proven yet. The in vitro model embryoid bodies (EBs) was used to investigate the expression of Brachyury, Mesp1 and Wnt signaling during early embryogenesis, whereas cardiac bodies (CBs) reflected the expression during cardiomyogenesis. The expression levels were reported either by flow cytometry analysis (Brachyury and Mesp1) or by luminiscence (Wnt signaling pathway). We could demonstrate the transient upregulation of Brachyury and Mesp1 promoter-driven EGFP at day 5 of ESC aggregation and we showed that CVPC derived CBs are five days ahead in differentiation compared to EBs, as both, Brachyury and Mesp1 promoter-driven EGFPs, were found in the beginning of differentiation and disappeared thereafter. Furthermore we demonstrated the responsiveness of the TOPflash reporter cell line to Wnt signaling. This enabled us to test the influence of a GSK-inhibitor (CHIR) and a TGF-β inhibitor (SB 431542) on the expression of the reporter genes. These experimental data foster the understanding of the transcriptional network regulating heart differentiation and will contribute to the improvement of strategies to efficiently differentiate somatic stem cells into fully functional cardiac muscle cells.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
CVPC ESC Brachyury Mesp1 Wnt Signaling Pathway Cardiomyogenesis
Schlagwörter
(Deutsch)
KVZ ESZ Brachyury Mesp1 Wnt Signaltransduktionsweg Kardiomyogenese
Autor*innen
Lucia Maria Leitner
Haupttitel (Englisch)
Establishment of reporter cell lines for the characterization of Brachyury and Mesp1 expression during in vitro cardiomyogenesis
Paralleltitel (Deutsch)
Herstellung von Reporterzelllinien zur Charakterisierung von Brachyury und Mesp1 Expression während der In Vitro Kardiomyogenese
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
135 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Georg Weitzer
Klassifikationen
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC11594216
Utheses ID
25584
Studienkennzahl
UA | 441 | | |
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