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Etablierung und Charakterisierung eines primären porcinen Urothelmodells zur Evaluierung neuer Therapieansätze bei Harnwegsinfektionen

Elena Elsa Sandrieser

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Michael Wirth

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29940.51373.924770-0

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit wurde ein neues Zellkultur-Modell, basierend auf gesunden, primären porcinen Urothelzellen, etabliert, das für die biopharmazeutische Evaluierung biorekognitiv modifizierter Drug Delivery Systeme im Rahmen einer Verbesserung der Behandlung von schwierig zu therapierenden Formen von Harnwegsinfekten eingesetzt werden kann. Das Hauptaugenmerk lag dabei zunächst auf der Optimierung eines Isolierungsprotokolls aus der Literatur, das ursprünglich für die Gewinnung primärer menschlicher Urothelzellen beschrieben wurde. Dabei wurde festgestellt, dass eine Stripping-Temperatur von 4°C über Nacht zu einer deutlich besseren Zellausbeute bei der Isolierung vor allem auch in Hinblick auf den nachfolgenden Kultivierungserfolg führte, als dies bei 37°C der Fall war. Bezüglich des antibiotischen Zusatzes zum Kultivierungsmedium führte Gentamycin in einer Konzentration von 60 μg/ml zum besten Ergebnis. Trotz der hohen Konzentration des Antibiotikums war hier kein negativer Einfluss auf das Wachstum oder die Viabilität der Zellen zu beobachten und eine Eradikation eventuell vorliegender Fremdkeime sollte dadurch gewährleistet sein. Generell konnte gezeigt werden, dass sich gesunde primäre porcine Urothelzellen erfolgreich in Kultur nehmen lassen und auch für eine Langzeitkultivierung geeignet sind. Um zu eruieren, ob sich das neu etablierte Zellkultur-System auch zur Evaluierung Lektin-modifizierter Arzneistoffe oder Trägersystemen, die zur Behandlung von Harnwegsinfekten eingesetzt werden könnten, eignet, wurde eine erste Charakterisierung der Glykokalyx der porcinen Urothelzellen vorgenommen. Dazu wurden mit fünf ausgewählten Lektinen unterschiedlicher Zuckerspezifität Bindungsstudien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass Weizenlektin sowohl für Einzelzellen als auch für Monolayer das höchste Bindungspotential besitzt, wobei dieses weder durch mehrmalige Subkultivierung noch durch Kryo-Konservierung beeinflusst wird. Weiters konnte festgestellt werden, dass auch LCA, das mit den gleichen oder zumindest ähnlichen Bindungsstellen wie der für viele Harnwegsinfekte verantwortliche UPEC interagiert, eine konstante Bindungskapazität aufweist und somit neben WGA einen geeigneten Kandidaten für eine biorekognitive Modifikation darstellen könnte. Bei den Lektine PNA und UEA waren Schwankungen in den Bindungskapazitäten in Abhängigkeit von der Passagezahl zu beobachten. Dies deutet auf 26 eine eventuelle Änderung in den Galaktosamin- und Fucose-Seitenketten an der Zelloberfläche der Urothelzellen im Laufe einer längeren Kultivierung hin. Erste grundlegende Internalisationsstudien lieferten weitere Erkenntnisse, die im Rahmen einer Optimierung der instillativen Therapie von Harnwegsinfekten interessant sein könnten. So konnte mittels Pulse-Chase-Incubation und Einsatz des Ionophors Monensin die Aufnahme oberflächlich gebundener Fluoreszenz-markierter Lektine und deren Speicherung in endosomalen bzw. lysosomalen Kompartimenten nachgewiesen werden. Lektine könnten somit dabei helfen, daran gekoppelte Arzneistoffe näher an die in den IBCs eingeschlossenen Bakterien heranzubringen, wodurch eine leichtere Eradikation der pathogenen Keime möglich sein sollte. Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen also, dass primäre porcine Urothelzellen ein geeignetes Zellkultur-System für das Urothel im Rahmen erweiterter in vitro Untersuchungen im Bereich der Blase darstellen und auch zur biopharmazeutischen Evaluierung biorekognitiv modifizierter Drug Delivery Systeme zur instillativen Therapie und damit neuartiger therapeutischer Ansätze bei chronischen und rezidivierenden Formen von Harnwegsinfekten eingesetzt werden können.

Abstract

(Englisch)

Objective To establish an optimised protocol for the isolation and cultivation of porcine primary urothelial cells and to evaluate their potential applicability in preclinical biopharmaceutics providing a valid and robust urothelial cell model for future eradication assays to improve the treatment of urinary tract infections. Materials and Methods Primary cultures of porcine urothelium were established and characterised. The glycosylation state was assessed via lectin binding assays using both, single cells and monolayer culture. Internalisation studies should elucidate if energydependent uptake of lectins by porcine urothelial cells is possible. Furthermore, the impact of cryopreservation and long-term culture on the glycosylation pattern was determined via lectin binding assays. Results The isolation efficiency and culturability of porcine primary urothelial cells was optimised. Wheat germ agglutinin revealed the highest surface binding capacity and energydependent uptake at 37°C was observed for all lectins. The glycosylation pattern showed reproducable results, independent of passage and cryopreservation. Conclusion Primary porcine urothelial cells can serve as a valid, non-malignant model of the inner lining of the urinary bladder for preclinical assays. Due to the robust glycosylation pattern the presented cell culture model might be used to evaluate advanced glycan targeted delivery systems in the context of urinary tract infections.

Autor*innen

Elena Elsa Sandrieser

Haupttitel (Deutsch)

Etablierung und Charakterisierung eines primären porcinen Urothelmodells zur Evaluierung neuer Therapieansätze bei Harnwegsinfektionen

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

76 S.

Sprache

Deutsch

Beurteiler*in

Michael Wirth

Klassifikation

44 Medizin > 44.88 Urologie, Nephrologie

AC Nummer

AC10888602

Utheses ID

25755

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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