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Influence of covalently conjugated monodisperse polyethylene glycol chains on in vitro properties of antisense oligonucleotides and antisense phosphorothioates

Nasrin Shokrzadeh-Madieh

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Ernst Urban

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DOI

10.25365/thesis.28988

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29528.94247.680161-6

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Gene silencing ist ein wichtiger Prozess in der Unterdrückung unerwünschter Genexpression durch die Blockierung der mRNA-Aktivität. Antisense Oligonukleotide wurden entwickelt, um an Ziel-RNA durch Watson-Crick-Basenpaarung zu binden. Sie verändern die Funktion der Ziel-RNA durch verschiedene Mechanismen, wie transkriptionalen Arrest. Phosphorothioate sind eine der ersten Generationen von chemisch modifizierten Antisensemolekülen und werden als Rückgrat-modifizierte Arzneimittel bezeichnet. Dabei ist ein nicht-bindendes Schwefelatom im Phosphat-Rückgrat durch ein Sauerstoffatom ersetzt. Phosphorothioat-Substitutionen erhöhen die Resistenz gegen Nukleaseabbau und zeigen verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften. Dennoch ist die Zellaufnahme nach wie vor eine große Barriere für die therapeutische Verwendung von Antisense Oligonukleotiden. Antisense Oligonukleotide mit kurzen Polyethylenglykolketten (PEG12) wurden synthetisiert und deren Auswirkungen auf die Zellaufnahme in Säugetierzellen und ebenso deren Herunter-Regulationsaktivität auf die Zellen untersucht. Anti-Bcl-2- und anti-Galectin-oligodesoxyribonukleotide wurden für diese Experiment eingesetzt. Zunächst wurden anti-bcl-2- und anti-Galectin Phosphordiester und Phosphorothioate synthetisiert und gereinigt. Danach wurden PEG-Ketten definierter Länge mittels einem einfachen Biokonjugationsprozess am 3'-Ende und 5'-Ende der Oligonukleotide verknüpft. Die Analyse der Reinheit der Konjugate erfolgte mit Gelektrophorese und zeigte circa 50% Ausbeute, während mit Phosphorothioaten eine bessere Produktbildung am 3‘-Ende erzielt wurde. Die Analyse und Reinigung von den konjugierten Oligonukleotiden wurde mit HPLC und PAGE durchgeführt. CD-spektroskopische Analysen zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen Sekundärstrukturen von modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden. Determinierung der Schmelztemperatur hat ebenfalls bewiesen, dass die PEGylation keinen Effekt auf die Affinität zum Gegenstrang ausgeübt haben. Die Herunter-Regulation des Targetgens durch die modifizierten Oligonukleotide wurde mit einem Dual-Luciferase Reporter Assay in der Säugetierzelllinie MCF-7 untersucht. Im Vergleich zu den unkonjugierten, waren die konjugierten Phosphordiester Antisense Oligonukleotide gleich wirksam. Modifizierte Phosphorothioate führten zu einer effizienteren herunterregulierung, wenn sie in hohen Konzentrationen wie 10 pMol eingesetzt wurden. Anschließend wurde der Einfluss von den Konjugaten auf die Zellproliferation und Zelltoxizität mittels MTT-Test untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die PEGylierung keine zusätzliche Toxizität hervorgerufen hat, und in einigen Fällen wurde sogar eine geringe schützende Wirkung nachgewiesen. Die Daten zeigten, dass die Bindung von kurzen PEG-Ketten mit der pharmakologischen Wirkung von Antisense Oligonukleotiden nicht interferiert. Es könnte eine einfache Methode sein, um die pharmakokinetischen Eigenschaften zu verändern und möglicherweise die Toxizität von Phosphorothioat Oligonukleotiden zu vermindern.

Abstract

(Englisch)

Gene silencing is an important process in the suppression of unwanted gene expression by the blockage of mRNA activity. Antisense oligonucleotides were designed to bind to the target RNA through Watson-Crick base pairing interaction and alter the function of target RNA by various mechanisms such as transcriptional arrest. Phosphorothioates are one of the earliest generations of antisense chemical modifications and are referred as backbone-modified drugs, in which non-binding phosphate-backbone contains sulphur atoms instead of oxygen atoms. Phosphorothioate substitution greatly increases resistance against nuclease degradation and shows improved pharmacokinetic properties. Nevertheless, the cell uptake is still a major barrier in the therapeutic use of antisense oligonucleotides. I designed antisense oligonucleotides with short polyethylene glycol (PEG12) substitution and examined their effect on cell uptake into mammalian cells and their down-regulation activity. Antisense agents targeted at bcl-2 and galectin were used for this work. At first, anti-bcl-2 and anti-galectin phosphordiesters and phosphorothioates were synthesized and purified. Afterwards PEG chains with defined lengths were linked at the 3’-end and 5’-end of oligonucleotides by a simple bioconjugation process. The analysis of purity of the conjugates using PAGE demonstrated circa 50% conversion with phosphorothioates showing better reaction yields than phosphordiesters. The analysis and purification of conjugated oligonucleotide was performed with HPLC and PAGE. CD spectroscopic analysis showed no significant difference between secondary structures of modified and unmodified oligonucleotides. Determination of melting temperature likewise proved that PEGylation did not have an effect on counter strand affinity. The down regulation of the targeted gene by the modified oligonucleotides was examined with a Dual-Luciferase reporter assay in the mammalian MCF-7 cell line. Compared to their unmodified counterparts, PEGylated phosphordiester antisense oligonucleotides were equally effective. PEGylated phosphorothioates resulted in more efficient target down regulation when applied in high concentrations. Subsequently, the influence of conjugates on cell proliferations and cell toxicity was examined by MTT-test which, showed that no additional toxicity was caused by PEG. In some, even a small protective effect was detected. The data demonstrates that attachment of short PEGyl chains does not interfere with the pharmacological effect of antisense oligonucleotides, and may be an easy method to alter pharmacokinetic properties and possibly mitigate the toxicity of phosphorothioate oligonucleotides.

Autor*innen

Nasrin Shokrzadeh-Madieh

Haupttitel (Englisch)

Influence of covalently conjugated monodisperse polyethylene glycol chains on in vitro properties of antisense oligonucleotides and antisense phosphorothioates

Paralleltitel (Deutsch)

Einfluss von kovalent konjugierte monodispersen polyethylen glykol auf in vitro Eigenschaften von antisense Oligonukleotide and antisense Phosphorothioate

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

66 S.Ill., : graf. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Ernst Urban

Klassifikation

35 Chemie > 35.75 Nukleinsäuren

AC Nummer

AC11045597

Utheses ID

25868

Studienkennzahl

UA | 449 | | |

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