Detailansicht
Untersuchung der Trsansposon vermittelten Transgenese unter Verwendung von Bacterial Artificial Chromosomen (BAC) in der Maus
Ursula Lemberger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Michael Jantsch
DOI
10.25365/thesis.29088
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29795.40564.557962-0
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Herstellung transgener Tiermodelle ist in der Molekular Biologie ein unverzichtbares Werkzeug zur Erforschung von Genfunktionen, Krankheiten und für die Entwicklung neuer Therapeutika.
Unter den vielen vertebraten Modellorganismen stellt die Maus aufgrund ihrer hohen genetischen Ähnlichkeit zum Menschen, der relativ einfachen genetischen Manipulierbarkeit und des kurzen Generationszyklus das meist verwendete Modell für die Genetik und Molekularbiologie der Säugetiere dar. In den letzten Jahrzehnen wurden diverse Methoden zur Manipulation des Mäusegenoms und zur Herstellung transgener Tiere entwickelt, wobei die Vorkerninjektion rekombinanter DNA Sequenzen und virale Transduktion lange Zeit die bevorzugten Methoden für die Erzeugung transgener Mäuse mit stabil vererbbarer genomischer Integration des Transgenes darstellten. Obwohl beide Methoden von ihren jeweiligen Eigenheiten profitieren, konnten die gleichzeitig daraus entstehenden Probleme wie geringe Integrationseffizienz, technischer Aufwand und die hohen Sicherheitsanforderungen im Umgang mit Viren nicht überwunden werden. In den letzten Jahren wurde daher die Verwendung von Artifiziellen Bakterienchromosomen sogenannten bacterial artificial chromosomes (BAC) etabliert. BACs sind ringförmige DNA Plasmide über 100kb und bieten daher die Möglichkeit auch große Transgene und regulative Sequenzen in das Transgen zu inkludieren. Weiters überwinden sie auf Grund ihrer Größe die typischen Probleme kleiner Plasmide wie Konkatermerisation, und Stilllegung durch Integration in heterochromatische Bereiche des Genoms. BACs enthalten eigene cis- regulative Elemente, die die Expression des Transgens stabilisieren. Um die Integrationseffizienz zu erhöhen wurden BACs mit dem Transposonsystem kombiniert. Transposon vermittelte Transgenese basiert auf DNA Transposons, wobei die essentiellen Bestandteile eine Transposase und ein Vektorplasmid dessen Transgen von zwei ITR Elementen flankiert ist, darstellen. Die Transposase, ein Enzym das die ITR Seiten erkennt, bindet und sowohl das Ausschneiden des Transgens aus dem Vektor wie auch dessen Integration in das Wirtsgenom moderiert, wird entweder als eigenständiges Plasmid oder aber als mRNA in den Modellorganismus eingebracht. Der Erfolg dieser Methode wurde bereits mit kleineren Plasmiden zur Herstellung von transgenen Tieren und Zelllinien aufgezeigt. Von den verschiedenen etablierten Transposonsystemen scheinen mache geeigneter für die Transposition von großen Transgenen zu sein als andere.
Die hyperaktive Transposase Sleeping Beauty 100X (SB100X) wurde aus verschiedenen ausgestorbenen Knochenfischgenomen synthetisiert und hat sich in diversen Experimenten als sehr effizient in der Transposition von kleinen Plasmiden in Zebrafisch und Maus erwiesen. Um die Funktionalität von SB100X auch für große Plasmide zu ermitteln, wurde ein 220kb großes BAC das eine ITR flankierte DTR-IRES-tdTomato Kassette trägt, per Rekombination hergestellt. Das BAC wurde gemeinsam mit 2pl Pufferlösung die 5ng/μL SB100X mRNA enthielt, in den Vorkern von C57BL/6N Zygoten co-injiziert, wobei zwei verschiedene Konzentrationen verwendet wurden (1.0ng/μL und 2.0ng/μL). Als Positivkontolle wurde ein 6.3kb großes Venus Plasmid unter denselben Voraussetzungen injiziert. Das Venus Plasmid kodiert für ein grün fluoreszierendes Reportergen. Seine Transpositionsfunktionalität in Kombination mit SB100X war in unseren vorangegangenen Experimenten bereits bewiesen worden. Wobei eine Transpositionseffizienz von 62.3% in Mäusen erreicht werden konnte. Von den insgesamt 37 geborenen Tieren die durch die Vorkerninjektion des BAC Plasmides hergestellt wurden, wies keine Maus die erfolgreiche Integration des Transgenes auf. Auch in der Kontrollgruppe war nur eine Maus Venus positiv. Dieses unerwartet negative Resultat, lässt ein technisches Problem, wie die Degradierung der mRNA durch RNAsen vermuten, zumal die hohe Transpositionsrate von Venus durch SB100X bereits bewiesen wurde.
Ein weiteres Ziel der Masterarbeit was der Vergleich von Vorkerninjektion und zytoplasmatischer Injektion zur Herstellung von Transposon vermittelter transgener Tiere. Die zytoplasmatische Injektion wird inzwischen in großen Säugetieren wie Schwein und Kuh routinemäßig durchgeführt, und ist technisch weniger aufwendig und weniger invasiv als die Injektion von Plasmiden in den kleinen Vorkern. Für dieses Experiment wurden wiederum das bereits etablierte Venus Plasmid verwendet, wobei 2pL Injektionsmix bestehend aus 0.4ng/μL Venus Plasmid und 5.0ng/μL SB100X in das Zytoplasma von C57BL/6N Zygoten co-injiziert wurde. Als Referenz wurden die Ergebnisse der Vorkerninjektion von Venus aus dem vorangegangen Experiment verwendet, da beide Versuche unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden. Insgesamt konnten 14 venustransgene Mäuse hergestellt werden, was einer Integrationsrate von 31.1% entspricht. Damit weist die zytoplasmatische Injektion nur halb so viel Erfolg wie die Vorkerninjektion auf (62.3% transgenene Tiere).
Abstract
(Englisch)
Transgenesis is a cornerstone of biomedical research. The alteration and manipulation of the genome is essential for understanding biological mechanisms and exploring medical aberrations. In the last few decades, different methods were developed to generate transgenic animals, where the focus was on designing a technique for efficient and simple transgenesis, which could be applied to a variety of model systems.
In contrast to classical techniques such as pronuclear injection and lentiviral transfection of early embryos, transposon mediated transgenesis using bacterial artificial chromosomes (BAC) represents a relatively new method to generate transgenic founders. BAC transgenesis has many advantages over classical approaches, like full-length integration, reduced position effect variation and a decreased gene silencing. However, the efficiency of BAC transgenesis is low and requires the development of new techniques. A possible approach is BAC transgenesis mediated by transposases, which has been shown to be successful in mice, zebrafish and embryonic stem cells. BAC plasmids of up to 160kb have been successfully transposed and the limit of cargo capacity is still undetermined.
The first aim of this study was to find out if the hyperactive transposase Sleeping Beauty100X is able to integrate a large BAC (over 200kb) in mice. Therefore, a ~220kb plasmid was generated by recombineering using the BAC RP23-190D1 (backbone vector: pBACe3.6). The target gene cassette is flanked by two ITR sites, suitable for transposition and includes a diphtheria toxin receptor (DTR), an internal ribosome entry site (IRES) and the red fluorescent reporter gene tdTomato. The expression of the target cassette is controlled by the regulatory elements of the mouse S100a4 gene. Pups were analyzed by fluorescence screening and PCR genotyping. However, no transgene positive mice could be generated in this study.
The second aim of this study was to compare the capability and efficiency of cytoplasmic with pronuclear microinjection in the SB100X transposon system. A 6.3kb Venus plasmid, which encodes for a green fluorescence protein was co-injected with SB100X mRNA into the cytoplasm of murine zygotes and compared to a previous study where the same mixture was injected into the pronucleus. The pronuclear injection resulted in 62.3% transgenic offspring, whereas only 31.1% of the cytoplasmic injected animals generated in this study were transgenic. Integration sites of the transposon were identified by linker-mediated PCR followed by sequencing.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Transposon-mediated Transgenesis BAC Sleeping Beauty SB100X
Schlagwörter
(Deutsch)
Transposon vermittelte Transgenese BAC Sleeping Beauty SB100X
Autor*innen
Ursula Lemberger
Haupttitel (Englisch)
Untersuchung der Trsansposon vermittelten Transgenese unter Verwendung von Bacterial Artificial Chromosomen (BAC) in der Maus
Paralleltitel (Englisch)
Investigation of transposon-mediated transgenesis using Bacterial Artificial Chromosmes (BAC) in the mouse
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
71 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael Jantsch
Klassifikationen
42 Biologie > 42.03 Methoden und Techniken der Biologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC11640284
Utheses ID
25961
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |