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Experimental evaluation and optimization of membrane proteome profiling techniques employing HPLC and orbitrap mass spectrometry
Selin Hizal
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Christopher Gerner
DOI
10.25365/thesis.29115
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30113.07136.903769-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Membranproteine vollziehen viele wichtige Funktionen in der Zelle, wie den Transport von Ionen und Molekülen, Zellsignalprozesse, Immunantwort und Regulation der Proteinsynthese. Etwa ein Drittel der offenen Leseraster kodieren Membranproteine und deren Funktionsstörung können mit folgenschweren humanen Krankheiten wie Krebs, Alzheimer, Diabetes und Herzerkrankungen verbunden sein. Daher können proteomische Analysen mit Schwerpunkt auf Membranproteinen wichtige Erkenntnisse über molekulare Mechanismen, die in der Zelle stattfinden, liefern.
„Proteome Profiling“ ist eine gut etablierte Technik, die im Wesentlichen auf der Isolation von Proteinen, der nachfolgenden Trennung proteolytischer Peptide und der Identifikation mittels Peptidfragmentierung in Massenspektrometer beruht. Die Identifikation von Membranproteinen stellt allerdings eine besondere Herausforderung dar, weil sie nicht nur in äußerst geringen Mengen vorliegen, sondern zusätzlich durch ihre Hydrophobizität und die geringe Anzahl tryptischer Schnittstellen nur unzureichend mit Standardmethoden zu erfassen sind. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden unterschiedliche Strategien bezüglich Ihrer Eignung Membranproteine zu identifizieren getestet, verglichen und optimiert. Zuerst wurden zytoplasmatische und Kernfraktionen von Jurkatzellen isoliert, die mit einem Standardprotokol verdaut und analysiert wurden. Diese wurden dann mit Membran-angereicherten Fraktionen (Membranen, Organellen und Kerne) verglichen, die mittels N2-Aufschluß und Ultrazentrifugation isoliert wurden. Ferner wurden mit einem Aufschlußkit (Protein Extraction Kit von Thermo Scientific) Membran- und zytoplasmatische Fraktionen isoliert.
Die Proben wurden mit verschiedenen Methoden gereinigt, verdaut und analysiert. Neben Trypsin wurde für den Verdau der Membran-angereicherten Fraktionen auch Chymotrypsin eingesetzt, da dieses Proteine an hydrophoben Aminosäuren (Phe, Tyr, Trp) schneidet, die in Intramembranregionen häufig vorkommen. Alternativ enthielt der Hydrogencarbonatpuffer, in dem Trypsin verdünnt wurde, 20 % Acetonitril, um hydrophobe Domänen für Trypsin besser zugänglich zu machen. Die Trennung erfolgte über einen 4 Stunden-Gradienten auf einer C18 Säule und die Analyse mit einem QExactive Orbitrap Massenspektometer unter Verwendung einer Top12 Methode. Mit den N2-aufgeschlossenen Fraktionen (Membranen und Organellen) war es möglich eine große Anzahl an Membranproteinen zu identifizieren. Besonders die Membranprobe enthielt viele genuine Membranproteine, die in der Zelle an lebenswichtigen biologischen Prozessen wie zelluläre Kommunikation, Signaltransduktion und Immunrreaktion teilnehmen.
Abstract
(Englisch)
Membrane proteins perform several important functions in the cell, including the transport of ions and molecules, cell signalling, immune response and regulation of enzymes and protein synthesis. Functionally, they can be receptors, ion channels, active transporters or enzymes located in the membrane. Malfunctioning of membrane proteins (MP) has been linked to important human diseases such as cancer, Alzheimer’s disease, diabetes, and cardiac disorders. As such, proteomic analyses with a focus on membrane proteins can provide important insight into molecular mechanisms operating in the cell and also allow the discovery of new drug targets.
Proteome profiling using shotgun proteomics involves the steps of isolation of fractions from cultured cells, electrophoretic separation of the proteins in the sample fraction, digestion with a protease such as trypsin, chromatographic separation of the protein digests, and mass spectrometric analysis in the form of nano-flow LC-MS/MS. The "fingerprint" of each peptide's fragmentation mass spectrum is used to identify the protein from which they derive by searching against a sequence database with commercially available software (e.g. MASCOT). In spite of their enormous significance, the analysis of membrane proteins by standard LC-MS experiments is notoriously difficult. With their low abundance added to their hydrophobicity, the coverage of hydrophobic peptides is usually relatively low.
In this master’s thesis, various strategies were applied and compared with respect to their ability to capture membrane proteins and optimized. Cytoplasmic and nuclear fractions were isolated from Jurkat cells, which were separated, digested and analysed by an established standard protocol. On the other hand, membrane-enriched fractions were isolated by disrupting the cells with freeze-thaw cycles using liquid N2 and afterwards ultracentrifugation. Membrane and cytoplasmic samples were also prepared using a Protein Extraction Kit von Thermo Scientific. In addition to trypsin, chymotrypsin was used for the digestion of various samples. A digestion protocol where the digestion buffer contained 20 % ACN was also tested. A four hour gradient was used for the separation of the peptides and a top12 method for the mass spectrometric analysis on a QExactive Orbitrap instrument by Thermo Scientific.
With the membrane-enriched samples, a large number of membrane proteins were identified. Especially the membrane fraction digested with trypsin contained many intrinsic plasma membrane and organelle membrane proteins, that perform important functions in the cell as receptors, transporters or ion channels, and participate in vital biological processes such as cell communication, signal transduction and immune reaction.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
membrane proteins mass spectrometry
Schlagwörter
(Deutsch)
Membranproteine Massenspektrometrie
Autor*innen
Selin Hizal
Haupttitel (Englisch)
Experimental evaluation and optimization of membrane proteome profiling techniques employing HPLC and orbitrap mass spectrometry
Paralleltitel (Deutsch)
Experimentelle Evaluierung und Optimierung von Membranprotein-Profiling Verfahren mittels HPLC und Orbitrap Massenspektrometrie.
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
66 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christopher Gerner
Klassifikation
35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges
AC Nummer
AC11639635
Utheses ID
25981
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |