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Influence of H2S on the transcription factors HIF-1α and NF-κB in THP-1 macrophages
Lilian Lohninger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Marcela Hermann
DOI
10.25365/thesis.29192
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29780.23234.410354-8
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Für die Regulierung der Sauerstoffversorgung in Säugetierzellen ist der Transkriptions-faktor HIF-1 essentiell. HIF-1 ist ein Heterodimer bestehend aus einer O2-abhängigen Untereinheit, HIF-1α, und einer konstitutiv expremierten Untereinheit, HIF-1β. Hypoxi-sche Verhältnisse in der Zelle führen zu einer Akkumulierung von HIF-1α, während nor-male Sauerstoffverhältnisse zu einem Abbau von HIF-1α durch das Proteosom führen. Es existieren jedoch auch Stimuli, die HIF-1α unter normoxischen Bedingungen stabili-sieren, wie zum Beispiel spezifische Wachstumsfaktoren, ROS und NO. Den stabilisie-renden Effekt von Hypoxie auf HIF-1α konnten wir während allen unseren Experimenten bestätigen.
Die Funktion von H2S im physiologischen System ist bis dato erst wenig erforscht. So-gar die grundlegende Frage, ob H2S die Zelle schützt oder schädigt, ist noch nicht voll-kommen geklärt. Die vielen offenen Fragen bezüglich H2S im physiologischen System führten uns dazu die Bedeutung von H2S genauer zu erforschen. Budde und Roth stell-ten bereits die Vermutung auf, dass H2S die HIF-1α Proteinexpression in C. elegans er-höhen kann. Basierend auf dieser Vermutung war unser Ziel zu untersuchen, ob H2S auch die Proteinexpression von HIF-1α in THP-1 Makrophagen steigern kann. Dazu be-nutzten wir einen synthetischen H2S-Donor namens GYY4137. Durch unsere For-schungsarbeit konnten wir zeigen, dass 1 mmol/l GYY4137 zu einem signifikanten An-stieg der HIF-1α Proteinexpression in THP-1 Zellen führt. Der beobachtete stimulierende Effekt von GYY4137, als H2S-Donor, auf HIF-1α wurde von uns zum ersten Mal postu-liert. Weiters konnten wir zeigen, dass die Inkubation von THP-1 Zellen mit GYY4137 unter hypoxischen Bedingungen zu einem zusätzlichen Anstieg von HIF-1α führt. Die Aktivierung von HIF-1α führt zur Migration des Proteins in den Kern. Unsere Untersu-chungen konnten zeigen, dass GYY4137 zur Akkumulation von HIF-1α im Kern von THP-1 Makrophagen führt. Über welchen Signalweg H2S die Aktivierung von HIF-1α bewirkt ist zur Zeit noch unklar.
Das Protein GLUT1 (Glukosetransporter 1) ist für die Glukoseaufnahme in die Zelle zu-ständig, wobei die Proteinexpression von GLUT1 durch HIF-1α eingeleitet wird. Wäh-rend unseren Untersuchungen konnten wir feststellen, dass GYY4137 die Proteinex-pression von GLUT1 erhöht, welche wiederum durch hypoxische Verhältnisse während der Inkubation mit dem H2S-Donor in THP-1 Zellen zusätzlich verstärkt wurde.
NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor dessen Zielproteine unter anderem eine Rolle in den folgenden Bereichen spielen: Kontrolle der Apoptose, Zelladhäsion, Zellproliferation, angeborene und erworbenen Immunantwort, Entzündung und zelluläre Reaktion auf Stress. Es existieren Proteine, die von beiden beschriebenen Transkriptionsfaktoren, HIF-1α und NF-κB, aktiviert werden können. Außerdem gibt es Reize, die HIF-1α und NF-κB aktivieren, wie zum Beispiel Cytokine und ROS. Auch während entzündlichen Prozessen und hypoxischen Episoden in der Zelle spielen beide Faktoren eine wichtige Rolle. Diese Übereinstimungen zwischen HIF-1α und NF-κB führten uns dazu, zu unter-suchen, ob HIF-1α durch den NF-κB Signalweg aktiviert werden kann. Aus einschlägiger Literatur war uns bereits bekannt, dass der Promoter von HIF-1α eine funktionelle NF-κB Bindungsstelle besitzt. Wir konnten zeigen, dass GYY4137 in THP-1 Zellen zu einer Zunahme des Inhibitors von NF-κB, IκB, und zu einer Abnahme der NF-κB Untereinhei-ten p105, p50, p65 und pp65 führt. Die Schlussfolgerung, dass die Erhöhung von IκB konsequenterweise zu einer Abnahme von NF-κB führt, konnte während unseren Unter-suchungen bestätig werden. Die erlangten Ergebnisse führten zu dem Fazit, dass die Akkumulation von HIF-1α durch H22 nicht über den NF-κB Signalweg initiiert wird, da sich GYY4137 gegensätzlich auf die beiden Transkriptionsfaktoren auswirkt. Ob die Zunahme von HIF-1α und die Abnahme von NF-κB auf irgendeine andere Art miteinan-der verbunden sind, ist noch unklar. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um mög-liche gemeinsame Aktivatoren ausfindig zumachen.
Die Arbeitsgruppe um Fähling et al. konnte zeigen, dass die Blockierung von p38 zu einer Abnahme der HIF-1α Proteinexpression führt. Entzündungsreize und Reize, die Stress in der Zelle hervorrufen, können zur Aktivierung des NF-κB Signalweg als auch des p38 MAPK Signalweg führen. Dieses Wissen führt uns zu einer weiteren Frage, nämlich ob die Aktivierung von HIF-1α oder NF-κB durch den p38 MAPK Signalweg initiiert werden kann. Um dies zu untersuchen benutzen wir einen Inhibitor, namens SB202190. SB202190 blockiert p38 und dadurch den gesamten p38 MAPK Signalweg. Wir kamen zu der Erkenntnis, dass der p38 Inhibitor zu einer Abnahme von IκB führt. Diese Beobachtung war jedoch insofern unschlüssig, als verminderte IκB Konzentration zu einem Anstieg von NF-κB führen sollte, was wir jedoch nicht beobachten konnten. Inkubation von THP-1 Zellen mit SB202190 resultierte sogar zu einer Abnahme mancher NF-κB Untereinheiten vor allem unter hypoxischen Bedingungen. Die beobachteten Effekte des p38-Inhibitor führten uns zu dem Schluss, dass der p38 Signalweg NF-κB beeinflussen kann. Weiters beobachteten wir, dass die durch GYY4137 induzierte Ak-kumulation von HIF-1α durch SB202190 in THP-1 Zellen reduziert wird. Das führte uns zu dem Fazit, dass die Aktivierung von HIF-1α durch GYY4137 zumindest zum Teil durch den p38 MAPK Signalweg reguliert wird. Um unsere Ergebnisse zu bestätigen sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig.
Abstract
(Englisch)
In mammalian cells, the transcription factor HIF-1 is essential for the regulation of oxy-gen supply. HIF-1 is a heterodimer composed of the O2-dependent HIF-1α subunit and the constitutively expressed HIF-1β subunit. Hypoxia results in an excessive upregula-tion of HIF-1α protein expression, whereas it is abolished under normal oxygen supply due to proteosomal degradation. There are also several stimuli which stabilize HIF-1α under normoxic conditions, e.g. specific growth factors, ROS and nitrogen species. Throughout our investigations we could confirm the increasing effect of hypoxia on the HIF-1α expression.
Currently, little is known about the function of H2S in the physiological system. Even, if H2S has protective or damaging effects on living organisms is unclear to date. Thus, we aimed to get further insights into the meaning of hydrogen sulfides. Budde and Roth constituted that H2S increases HIF-1α in C. elegans. Acting on this assumption, our aim was to investigate whether H2S also enhances HIF-1α protein expression in THP-1 macrophages. Therefore we used a synthetic hydrogen sulfide donor, called GYY4137. In this analysis we could show that 1 mmol/l GYY4137 results in a significant enhance-ment of HIF-1α in THP-1 macrophages. The increasing effect of GYY4137, as H2S-releaser, on HIF-1α was exhibited by us for the first time.
We also found that incubation of the cells with GYY4137 under hypoxic conditions re-sults in an even more increased HIF-1α signal. HIF-1α migrates into the nucleus when it is activated. In this study we could demonstrate that GYY4137 was able to increase HIF-1a protein expression in the nucleus in H2S treated macrophages. The pathway, by which H2S initiates the activation of HIF-1α, is by now not investigated.
An important target protein of HIF-1α is the glucose transporter GLUT1, which mediates cellular glucose uptake. During our investigations we found that GYY4137 has a similar effect on GLUT1. Our evaluations showed that GLUT1 increases after H2S incubation and is even more enhanced after incubation with H2S under hypoxic conditions in
THP-1 macrophages.
NF-κB is a transcription factor, whose target genes are involved in controlling apopto-sis, cell adhesion, proliferation, innate- and adaptive immune response, inflammation, cellular stress response and tissue remodelling. HIF-1α and NF-κB share target genes and are in part activated by the same stimuli like ROS or cytokines. They are both im-portant factors during inflammation and hypoxic episodes. This was the initial point to investigate whether HIF-1α accumulation can be mediated by the NF-κB pathway as it is known from the literature that the HIF-1α promoter has a functional NF-κB site. We found that the inhibitor of NF-κB, IκB, increases and that the NF-κB subunits p105, p50, p65 and pp65 decline in THP-1 cells after incubation with GYY4137. Upregulation of IκB results in a downregulation of NF-κB subunits. This downregulation of NF-κB subunits could be observed throughout our investigations. These findings lead us to the assump-tion that HIF-1α activation due to H2S does not proceed via the NF-κB pathway because the opposite influences of GYY4137 on HIF-1α and NF-κB subunits exclude this possi-bility. If these findings are connected anyhow, is yet unknown. To investigate possible collective activators, onward investigations are necessary.
Fähling et al. showed that inhibition of p38 leads to a decrease of HIF-1α protein ex-pression. The NF-κB and also the p38 MAPK kinase pathway can be induced by in-flammatory and cell stress stimuli. This led us to another aim during our analysis, which was to investigate if HIF-1α or NF-κB activation can happen via the p38 MAPK pathway. Therefore we used a p38 MAPK inhibitor, called SB202190, which inhibits the signal transduction of the MAPK pathway by blocking the p38 activity. The attenuation of IκB as reaction on the inhibition of the p38 MAPK pathway is confusing, because an attenu-ated IκB activity results in an increase of NF-κB, which we could not observe. We found little effects on the NF-κB subunits or they were even declined after incubation with SB202190 under hypoxia. We found that HIF-1α accumulation due to GYY4137 de-creases in THP-1 macrophages after incubation with SB202190, what leads us to the assumption that GYY4137 regulates HIF-1α at least in part by the p38 MAPK pathway. Further analysis is required to confirm our results.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
H2S GYY4137 HIF-1aöpha NF-kappaB
Schlagwörter
(Deutsch)
H2S GYY4137 HIF-1aöpha NF-kappaB
Autor*innen
Lilian Lohninger
Haupttitel (Englisch)
Influence of H2S on the transcription factors HIF-1α and NF-κB in THP-1 macrophages
Paralleltitel (Deutsch)
Einfluss von H2S aud die Transkriptionsfaktoren HIF-1α und NF-κB in THP-1 Makrophagen
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
108 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Hildegard Laggner
AC Nummer
AC11662048
Utheses ID
26043
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |