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Lentivirus Vector-Mediated Expression of Fluorescent Proteins in Human Melanoma Cell Lines and their Characterisation for In Vivo Visualisation of Tumour Growth
Michaela Fischer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Pavel Kovarik
DOI
10.25365/thesis.29196
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29200.84212.111766-3
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Maligne Melanome sind die Ursache für ungefähr 75 % der Todesfälle innerhalb der Gruppe des Hautkrebs. Daher ist es sehr wichtig dafür neue therapeutische Ansätze in entsprechenden in vitro Experimenten und in vivo Modellsystemen zu testen. In den vergangenen Jahren hat die antikörper-basierte Immuntherapie große Fortschritte im Kampf gegen maligne Tumore gemacht. Ein vielversprechender Antikörper ist der rekombinante bispezifische Einzelketten-Antikörper r28M, der sowohl gegen das Chondroitinsulfat-Proteoglycan 4 (CSPG4) auf verschiedenen Tumorzellen, darunter Melanom- und Glioblastomzellen, als auch gegen das co-stimulatorische CD28 Antigen auf humanen T-Zellen gerichtet ist. Daher kann der r28M Antikörper die Aktivierung von humanen T-Zellen ohne Signalisierung über den TCR/CD3 Komplex bewirken, was zum Absterben der Tumorzellen führt. Um Tumore und den möglichen Effekt des r28M Antikörpers auf diese in Mäusen sichtbar zu machen, können mittels lentiviraler Vektoren Gene für Fluoreszenzproteine mit Emissionsspektren in den roten und dunkelroten Wellenlängen in Tumorzellen transduziert werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Herstellung und Charakterisierung von verschiedenen, mit den Genen für die Fluoreszenzproteine mCherry und mKate2-transduzierten, Melanomzelllinien. Dafür wurden via Calcium-Phosphat-Präzipitation HIV-basierte lentivirale Vektoren, pseudotypisiert mit der VSV-G Hülle, produziert und diese für Infektionen der Melanomzelllinien A-375, SK-MEL-28 und IPC-298 benutzt. Um Populationen von RFP-expremierenden Zellen zu erhalten wurden die transduzierten Zellen entweder nur mittels Blasticidin oder mittels Blasticidin mit anschließender FACS-Sortierung selektiert. Diese Zellen wurden dann via Durchflusszytometrie auf Transduktionsstabilität und Stärke ihres emittierten Fluoreszenzsignals hin untersucht. Um Unterschiede im Wachstums-verhalten zwischen parentalen und transduzierten Melanomzellen auszuschließen, wurden Wachstumskurvenanalysen und Verdopplungszeitenberechnungen durchgeführt. Nachdem sowohl via Durchflusszytometrie die Präsenz des CSPG4 Antigens auf den Melanomzellen als auch mittels Western Blot die relative Menge der CSPG4-Expression herausgefunden wurden, wurde der r28M Antikörper auf seine Fähigkeit hin getestet, die Zerstörung der transduzierten Tumorzellen in vitro auszulösen. Daraufhin wurden mCherry- und mKate2-transduzierte A-375 Zellen subcutan in haarlose Mäuse injiziert um die daraus resultierenden Tumore mittels dem IVIS 50 (Xenogen in vivo Imaging System) zu visualisieren. Um ein Metastasenmodel des Gehirns zu etablieren wurden die A-375 und SK-MEL-28 Zelllinien, beide mit dem Gen für mCherry transduziert, direkt in die Gehirne von NSG Mäusen injiziert und die daraus entstandenen Tumore via IVIS visualisiert.
Wir konnten mCherry- und mKate2- transduzierte A-375, SK-MEL-28 und IPC-298 Zellen erzeugen, die stabile Transduktionsraten und Wachstums-eigenschaften ähnlich zu denen der parentalen Zellen aufwiesen. Des Weiteren wiesen wir das Zielantigen CSPG4 auf nahezu allen untersuchten Melanomzellen nach. Zusätzlich zeigten wir vergleichbare Mengen an CSPG4-Expression zwischen parentalen und transduzierten Zellen, woraufhin die A-375 Zelllinie in vitro von den PBMCs am effektivsten zerstört wurde, wenn der r28M Antikörper in seiner dimeren Form zugegeben wurde. Die Tumore, die nach subcutaner Injektion der mCherry- oder mKate2-transduzierten A-375 Zellen gebildet wurden, konnten via IVIS in den immundefizienten Mäusen nachgewiesen werden. Auch die Gehirntumore der NSG Mäuse konnten durch Schädelknochen und Kopfhaut detektiert werden.
Wir konnten nachweisen, dass die Virusinfektion und die Expression der Fluoreszenzproteine weder das Wachstumsverhalten der transduzierten Zellen, noch deren CSPG4-Expression beeinflusste. Des Weiteren waren die Tumore nach Injektion der transduzierten Zellen in immundefiziente Mäusen nicht-invasiv detektierbar.
Die Vorgehensweisen, die in dieser Diplomarbeit beschrieben werden, werden in Zukunft als Basis für eine nicht-invasive Visualisierung von Tumoren und deren Ansprechen auf medizinische Substanzen in pre-klinischen Tierversuchen genutzt.
Abstract
(Englisch)
Within the group of skin cancer, malignant melanomas are the cause for about 75 % of deaths. Therefore, it is of high importance to test new therapeutic approaches in relevant in vitro experiments as well as in in vivo model systems. In recent years antibody-based immunotherapy has made great progress in the fight against malignancies. One promising antibody is the recombinant bispecific single-chain antibody r28M, which is directed against the Chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4) on several types of tumour cells, including melanoma and glioblastoma cells, as well as the co-stimulatory CD28 antigen on human T-cells. Thus, r28M is able to induce activation of human T-cells without additionally signalling via the TCR/CD3 complex, which results in an effective killing of the tumour cells. To visualise tumours and the therapeutic effect of the r28M antibody on tumour cells in mice, genes for red and far-red fluorescence proteins can be stably transduced into these cells via lentiviral vectors.
The aim of this thesis was the generation and characterisation of different melanoma cell lines transduced with the genes for the fluorescence proteins mCherry and mKate2. Therefore, HIV-based lentiviral vectors pseudotyped with the VSV-G envelope were produced via calcium-phosphate transfection and used for infections of the melanoma cell lines A-375, SK-MEL-28 and IPC-298. In order to obtain populations of RFP-expressing cells, transduced cells were selected by blasticidin only or by blasticidin treatment followed by FACS-sorting. These cells were then studied for transduction stability and strength of the emitted fluorescence signal by flow cytometry. To exclude differences in growth behaviour between parental and transduced melanoma cells, growth curve analysis and doubling time calculations were carried out. After confirming the presence of the CSPG4 antigen on the melanoma cells by flow cytometry as well as the relative amount of CSPG4-expression by Western blotting, the r28M antibody was tested for its ability to induce killing of the transduced tumour cells in vitro. Subsequently, mCherry- and mKate2-transduced A-375 cells were injected subcutaneously into nude mice to visualise the resulting tumours via the IVIS 50 (Xenogen in vivo Imaging System). To establish a brain metastasis model the A-375 and SK-MEL-28 cells both transduced with the gene for mCherry were injected directly into the brains of NSG mice, whereupon the emerged tumours could also be visualised non-invasively via the IVIS.
We could successfully generate mCherry- and mKate2-transduced A-375, SK-MEL-28 and IPC-298 cells with stable transduction rates and growth behaviour comparable to those of the parental cells. We found the target antigen CSPG4 to be present on almost all investigated melanoma cells. In addition, we showed similar amount of CSPG4-expression between parental and transduced cells, whereupon the A-375 cell line revealed to be killed most effectively by the PBMCs, when the dimeric form of the r28M antibody was applied in vitro. The tumours emerged by subcutaneous injection of the mCherry- or mKate2-transduced A-375 cells into immune-deficient mice were detectable via IVIS. Furthermore, the tumours in the brains of NSG mice could be monitored through skull and skin.
Thus, we could prove that virus infection and expression of the red fluorescence proteins neither altered the growth behaviour of the transduced cells, nor the expression of the CSPG4 antigen. Moreover, the tumours that had developed after injection of transduced melanoma cells into immune-deficient mice were detectable non-invasively.
The approaches described in this thesis will be used as a base for non-invasive visualisation of tumours and their response to medical substances in pre-clinical animal experiments in the future.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
malignant melanoma bispecific single-chain antibody r28M CSPG4 lentiviral vector mCherry mKate2 non-invasive in vivo visualisation
Schlagwörter
(Deutsch)
malignes Melanom bispezifischer Einzelketten-Antikörper r28M CSPG4 lentiviraler Vektor mCherry mKate2 nicht-invasive in vivo Visualisierung
Autor*innen
Michaela Fischer
Haupttitel (Englisch)
Lentivirus Vector-Mediated Expression of Fluorescent Proteins in Human Melanoma Cell Lines and their Characterisation for In Vivo Visualisation of Tumour Growth
Paralleltitel (Deutsch)
Lentivirus Vektor-vermittelte Expression von Fluoreszenzproteinen in humanen Melanomzelllinien und deren Charakterisierung für die In Vivo-Visualisierung von Tumorwachstum
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
102 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Pavel Kovarik
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC11662934
Utheses ID
26047
Studienkennzahl
UA | 490 | | |