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Analysis of the genetic stability of a GMO using real-time PCR and high resolution melting analysis
Sina-Elisabeth Ben Ali
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Alexander Haslberger
DOI
10.25365/thesis.29231
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29126.37283.681861-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Seit der Einführung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO´s) im Jahr 1997 sind GVO´s drastisch expandiert. Für die offizielle Kontrolle und Authorisierung von Lebensmitteln, Futtermitteln und Saatgut muss daher eine steigende Anzahl von GVO Events identifiziert sowie quantifiziert werden. In den letzten Jahren ist es neben der Detektion von GVO auch eine Herausforderung geworden, die genetische Stabilität von GVO Pflanzen zu untersuchen. Laut EFSA sowie der Richtlinie 2001/18/EC ist es notwendig, dass das trans- gene Konstrukt im GVO stabil ist. Für diese Kontrollen werden allerdings bei jedem GVO Event nur wenige Proben mittels Southern Blots analysiert, welche nicht für die Detektion von SNPs geeignet sind. In dieser Studie wurde eine hohe Anzahl transgener Maiskörner (individuelle Proben) mit Methoden analysiert, die auch kleinste DNA Änderungen erkennen können und daher die vorher beschriebenen Southern Blot Analysen ergänzen können. Die Experimente wurden an der dreifach-gestapelten GV-Mais Varietät 4421VT3 (MON863 x MON810 x NK603) durchgeführt. Zwei Methoden wurden angewandt: Real-time PCR mit Scorpion Primern und HRM Analyse. Zusätzlich wurde die konventionelle PCR für die Kartierung einer in NK603 detektierten Deletion verwendet. In dieser Studie wurden die Übergänge vom Konstrukt ins Genom untersucht, da diese auch für die Quantifizierung von GVO´s verwendet werden. Mittels HRM Analyse und Scorpion Primern wurde überprüft, ob eine Unterscheidung zwischen Wildtyp und Mutant möglich ist. Von 100 einzelnen Körnern wurde DNA extrahiert und anschließend ein Screening ausgewählter Regionen mittels Scorpion und HRM Analysen durchgeführt, um DNA Änderungen zu identifizieren. Potentiell positive Proben wurden sequenziert. In den Events MON810 und NK603 wurden nicht-publizierte Mutationen identifiziert. 11 SNPs wurden insgesamt in MON810 identifiziert. In NK603 wurde eine große Deletion, die vom 35S Promoter bis zum 3´Ende des Konstrukts reicht, entdeckt. Die Ergebnisse demonstrieren genetische Instabilität in dem analy- sierten dreifach-gestapelten Event. Da die Mais Varietät 4421VT3 in den USA bereits angepflanzt und konsumiert wird, sollten die Ergebnisse geklärt werden.
Abstract
(Englisch)
Since the introduction of GMOs in the EU in 1997 their use has drastically expanded. For the official control and authorization of food, feed and seeds it is therefore necessary to identify and quantify the increasing number of GMO events. In recent years - in addition to the detection of GMOs – it has also be- come a challenge to investigate the genetic stability of GM plants. According to EFSA and EU Directive 2001/18/EC, it is necessary that the introduced DNA construct in the GMO is stable. However, to control the genetic stability, at each GMO event few samples are analysed, and only by Southern Blots. This method is not suitable for SNP detection. In this study, a high number of transgenic maize seeds (individual samples) were investigated using methods that allow to detect even small DNA re- arrangements and subsequently provide additional information to the prescribed Southern Blot analyses. The experiments were carried out on the triple-stacked GM maize variety 4421VT3 (MON863 x MON810 x NK603). Two methods were utilised: Real-time PCR with Scorpion primers and HRM analysis. Furthermore, conventional PCR was used for the mapping of a deletion detected in NK603. The study examined the transitions from the construct into the genome, since they are also used for the quantification of GMOs. With HRM analysis and Scorpion primers this study aimed to check whether a distinction between wild- type and mutation is possible. From 100 individual seed grains DNA was extracted followed by a screening of selected regions using Scorpion and HRM analyses to identify DNA changes. Potentially positive samples were se- quenced. In the events MON810 and NK603 unpublished mutations were identified. A total of eleven SNPs was identified in MON810. In NK603 a large deletion ranging from the 35S promoter to the 3´end of the construct was discovered. The results demonstrate genetic instability in the analysed triple stacked event. The results have to be clarified since the maize variety 4421VT3 is already allowed for planting and consumption in the USA.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
GMO mutation SNP High Resolution Melting Scorpion primer genetic stability real-time PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
GVO Mutation SNP Schmelzkurvenanalyse Scorpion Primer Genetische Stabilität Real-time PCR
Autor*innen
Sina-Elisabeth Ben Ali
Haupttitel (Englisch)
Analysis of the genetic stability of a GMO using real-time PCR and high resolution melting analysis
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse der genetischen Stabilität eines GVO´s mittels Real-time PCR und hochauflösender Schmelzkurvenanalyse
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
95 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Alexander Haslberger
AC Nummer
AC11045756
Utheses ID
26081
Studienkennzahl
UA | 066 | 838 | |