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Knock-out mutants of respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120
Markus Mikulic
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Georg Schmetterer
DOI
10.25365/thesis.29247
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30466.82684.378070-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Knock-out Mutanten respiratorischer terminaler Oxidasen
im Cyanobakterium Anabaena sp. Stamm PCC 7120:
Cyanobakterien sind Bakterien, die oxygene Photosynthese, mit dem Nebenprodukt O2, betreiben.
Vorkommend in nahezu allen Habitaten der Erde, tragen sie 30 - 50 % zur globalen O2 Produktion bei. Sie
können auch aerobe Atmung mit O2 als terminalen Elektronenakzeptor betreiben. Dieser Prozess wird von
respiratorischen terminalen Oxidasen (RTO) katalysiert, die sich in der Thylakoid- oder Plasmamembran
befinden. Die Cyanobakterienstämme unterscheiden sich voneinander in Anzahl und Typen der vorhandenen
RTOs. In der Dunkelatmung wird während der Photosynthese aufgebautes Glykogen metabolisiert und ATP
generiert. In Cyanobakterien finden die aerobe Atmung und die Photosynthese im selben Kompartiment statt,
wobei wichtige Bestandteile der Elektronentransportkette, wie z. B. der Plastochinonpool, gemeinsam
genutzt werden. Manche Cyanobakterien, wie der filamentöse Anabaena sp. Stamm PCC 7120 (PCC 7120),
können in spezialisierten Heterozystenzellen N2 zu NH4
+, katalysiert durch die O2-sensitve Nitrogenase,
reduzieren. RTOs in PCC 7120: 1) 3 Häm-Kupfer Oxidasen: * echte mitochondrial-Typ Cytochrom-c-
Oxidase (Cox), essentiell für chemo-heterotrophes Wachstum; * 2 alternative, respiratorische, terminale
Oxidasen (ARTO), teilweise homolog zu Cox, keine Cytochrom c Oxidierbarkeit, nur in Heterozysten.
2) Cytochrom bd-Typ Oxidase (Cyd): Katalysiert Elektronenübertragung von Chinon zu O2, möglicher
Schutz des Chinonpools vor Überreduktion. 3) Plastidische terminale Oxidase (Ptox): Katalysiert
Elektronenübertragung von Chinon zu O2, möglicher Schutz des Chinonpools vor Überreduktion,
Sequenzähnlichkeit mit mitochondrialer, alternativer Oxidase (Aox).
Für die Konstruktion einer ptox Mutante wurde der rekombinante Vektor pMMUV6, mit einer N- und Cterminalen
Flankierungssequenz des ptox Gens all2096, disruptiert durch die Sm / Sp Resistenzkassette C.S3,
in 3 Schritten hergestellt. Durch Konjugation mit E. coli wurde pMMUV6 in PCC 7120 transferiert. Die
transformierten PCC 7120 wurden so kultiviert, dass auf homozygote Knock-out Mutanten selektiert wurde.
Nun vorliegende PCC 7120 RTO Mutanten: cox-, ptox- (diese Arbeit), cox- ptox- (diese Arbeit), cyd-, cox2-
cox3-, cox2- und cox3-.
Die endogene Atmung der verschiedenen PCC 7120 Stämme wurde im Dunkeln mit der Clark
Sauerstoffelektrode mit einer Zellsuspension von OD730 = 5 gemessen. Nach der Messung wurde der
Chlorophyllgehalt der Zellsuspension bestimmt. Entgegen der Erwartung variierten die bestimmten Werte
signifikant zwischen und innerhalb der verschiedenen RTO Mutanten und dem Wildtyp (Einheit:
μg · ml-1 [OD730 = 5]): WT 16.6, cox- 21.2, ptox- 14.6, cox- ptox- 25.7, cyd- 11.9. Diese große Variation deutet
darauf hin, dass die optische Dichte einer Zellsuspension filamentöser Cyanobakterien offensichtlich nicht
mit der Zellzahl in der Suspension korreliert. Die mikroskopische Analyse des Wildtyps und der RTO
Mutanten zeigte eine stammspezifische Filamentlänge, mit den meisten Wildtyp Filamenten aus 3 - 6 Zellen
bestehend, während die Mutanten hingegen signifikant längere Filamente aufwiesen. Dies könnte der Grund
für die großen Unterschiede im Chlorophyllgehalt sein. Folglich ist die bevorzugte und genaueste Maßeinheit
für die Atmungsrate auf den Chlorophyllgehalt bezogen. Die Mittelwerte der endogenen Atmungsrate pro mg
Chlorophyll (μmol O2 · h-1 · [mg Chlorophyll]-1) unterschieden sich signifikant zwischen den PCC 7120
Stämmen: WT 17.4, cox- 17.1, ptox- 25.0, cox- ptox- 13.0, cyd- 33.5. Die endogene Atmung war eine Reaktion
0. Ordnung und wurde durch die Zugabe von 50 mM Fruktose nicht gesteigert, obwohl PCC 7120 WT zu
chemo-organohetertrophem Wachstum mit mehr als 50 mM Fruktose befähigt ist. Alle PCC 7120 RTO
Mutanten zeigten klar erkennbare Atmungsaktivtät im Dunkeln. Dies zeigt, dass keine der RTOs essentiell
für die Atmung ist. Eine deutlich erhöhte Atmungsrate zeigte sich bei der Cyd und der Ptox Knock-out
Mutante. Die noch vorhandenen RTOs könnten hier den Verlust der anderen RTOs überkompensieren. Im
Vergleich zum Wildtyp verändert der Verlust der Cox die Atmungsrate nicht signifikant. Inhibitoren der
Zellatmung, die sich in früheren Arbeiten als für bestimmte RTOs spezifisch zeigten, wurden getestet:
0.67 mM KCN inhibierte die Atmungsaktivität von PCC 7120 WT komplett und die von cox- und ptox- um
97 - 98 %. PCC 7120 cox- ptox- mit der Cyd als einzig aktiver RTO war mit 95 % Inhibierung weniger KCN sensitiv.
Auffallend ist, dass die Atmungsaktivität von PCC 7120 cyd- durch die Zugabe von 0.67 mM KCN
sofort und komplett beendet wurde. Diese neue Entdeckung deutet darauf hin, dass nicht die Ptox, sondern
die Cyd die RTO mit reduzierter KCN-Sensitivität in PCC 7120 ist. Die Inhibierung der Atmung durch
80 μM HQNO (2-Heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide) variierte sehr stark (Einheit: % relative Inhibierung
der endogenen Atmungsrate): WT 26.0, cox- 39.6, ptox- 20.9, cox- ptox- 33.6, cyd- 32.3. Die Atmung von PCC
7120 cox- ptox- mit der Cyd als einzig aktiver RTO wurde nicht komplett durch HQNO inhibiert, im
Gegensatz zu der Synechocystis sp. PCC 6803 RTO Mutante, in der die Cyd als einzig aktive RTO mit 50
μM HQNO komplett inhibierbar war.
Keine der RTOs war für photoautotrophes Wachstum mit gebundenem Stickstoff und konstanter
Beleuchtung essentiell. PCC 7120 cox- ptox- zeigte langsameres Wachstum und höhere Empfindlichkeit
gegenüber Licht. Eine wichtige, neue Entdeckung ist, dass PCC 7120 cox-, cox- ptox- und cyd- nicht
photoautotroph auf N2 wachsen können.
Abstract
(Englisch)
Knock-out mutants of respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120:
Cyanobacteria are defined as bacteria performing oxygenic photosynthesis with O2 as by-product. Naturally
occurring in nearly all habitats worldwide, they account for 30 - 50 % of the O2 production on earth. They
can also perform aerobic respiration, where O2 functions as terminal electron acceptor. This process is
catalysed by respiratory terminal oxidases (RTOs), located in the thylakoid membrane or the plasma
membrane. The number and the different types of RTOs are very variable among the cyanobacterial strains.
Dark respiration generates ATP mostly from glycogen produced in photosynthesis. In cyanobacteria, aerobic
respiration and oxygenic photosynthesis occur in the same compartment, sharing major components of the
electron transport chain, like the PQ pool. Some cyanobacteria, such as filamentous Anabaena sp. PCC 7120
(PCC 7120) can reduce N2 to NH4
+ in specialised cells called heterocysts, catalysed by the highly O2-
sensitive enzyme nitrogenase. RTOs of PCC 7120: 1) 3 heme copper oxidases: * Genuine mitochondrial-type
cytochrome c oxidase (Cox), essential for chemo-organoheterotrophic growth; * 2 alternate respiratory
terminal oxidases (ARTO): Partly homologous to Cox, no cytochrome c oxidation, only expressed in
heterocysts. 2) Cytochrome bd-type oxidase (Cyd): Catalyses electron flow from quinol to O2, may prevent
PQ pool from over-reduction. 3) Plastidic-type oxidase (Ptox): Catalyses electron flow from quinol to O2,
may prevent PQ pool from over-reduction, has sequence similarities with mitochondrial alternative oxidase
(Aox).
For the construction of a PCC 7120 ptox mutant, recombinant vector pMMUV6, containing the N-terminal
and C-terminal flanking sequences of the ptox gene all2096 disrupted by the Sm / Sp resistance cassette
C.S3, was constructed in 3 steps. By conjugation with E. coli, pMMUV6 was transferred into PCC 7120. The
transformed PCC 7120 were cultivated to select for homozygous ptox knock-out mutants. Now available
homozygous PCC 7120 RTO mutants: cox-, ptox- (this work), cox- ptox- (this work), cyd-, cox2- cox3-, cox2-
and cox3-.
The endogenous respiration of the different PCC 7120 strains was measured in the dark with a Clark oxygen
electrode with a cell suspension of OD730 = 5. After the measurement, the chlorophyll content of the cell
suspension was determined. Contrary to the expectation, the determined values varied significantly between
and within the different RTO mutant strains and the wild type (units are μg · ml-1 [OD730 = 5]): wt 16.6,
cox- 21.2, ptox- 14.6, cox- ptox- 25.7, cyd- 11.9. This big variation indicates that the optical density of a cell
suspension with filamentous cyanobacteria is apparently not well correlated with the number of cells in the
suspension. The microscopic analysis of wild type and mutant cultures showed a strain specific variation in
filament length, with most of the wild type filaments having a length of only of 3 - 6 cells, whereas the
mutant strains mostly had significant longer filaments. This may have caused the big variations in
chlorophyll content. Hence, the preferred and most accurate measurement unit of the respiratory rate is
related to the chlorophyll content. The mean values of the endogenous respiratory rate per mg chlorophyll
(μmol O2 · h-1 · [mg chlorophyll]-1) varied significantly between the different strains: wt 17.4, cox- 17.1,
ptox- 25.0, cox- ptox- 13.0, cyd- 33.5. The endogenous respiration was a reaction of zero order and was not
enhanced by the addition of 50 mM fructose, although PCC 7120 wt was capable of chemoorganoheterotrophic
growth with more than 50 mM fructose. All PCC 7120 RTO mutants showed a clearly
detectable respiratory activity in the dark. Hence, none of the RTOs is essential for respiration. The knockout
of the Ptox or Cyd resulted in significantly higher endogenous respiratory rates. The remaining RTOs
may overcompensate the loss of one of these RTOs. The loss of the Cox did not alter significantly the
endogenous respiratory rate compared to the wild type. Respiratory inhibitors that were shown to be specific
for particular RTOs in previous works were tested: 0.67 mM KCN inhibited the respiratory activity of PCC
7120 wt completely and that of cox- and ptox- to about 97 - 98 %. PCC 7120 cox- ptox-, with the Cyd as sole
active RTO, was a little less sensitive with 95 % inhibition. Remarkably, the respiratory activity of PCC 7120
cyd- was completely and instantly inhibited by the addition of 0.67 mM KCN, indicating that the Cyd and not
the Ptox of PCC 7120 is the RTO with a reduced KCN sensitivity. The inhibition rates of respiration by
80 μM HQNO (2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide) varied significantly (units are % relative inhibition of
endogenous respiratory rate): wt 26.0, cox- 39.6, ptox- 20.9, cox- ptox- 33.6, cyd- 32.3. In PCC 7120 cox- ptoxthe
Cyd as only active RTO was not completely inhibitable by HQNO, whereas in a Synechocystis sp. PCC
6803 RTO knock-out mutant the Cyd as sole active RTO was completely inhibited by 50 μM HQNO.
In PCC 7120 none of the RTOs was essential for photoautotrophic growth with combined nitrogen and
constant light. PCC 7120 cox- ptox- showed a lower growth rate and was also more susceptible to light. The
inability of PCC 7120 cox-, cox- ptox- and cyd- to grow photoautotrophically without combined nitrogen is a
novel discovery.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Cyanobacteria Anabaena sp. PCC 7120 Anabaena sp. strain PCC 7120 Nostoc PCC 7120 respiratory terminal oxidases RTO respiration respiration measurement respiratory rate diazotrophic growth ARTO Cox Cyd Ptox cytochrome c oxidase alternate respiratory terminal oxidase cytochrome bd-type oxidase plastidic-type oxidase gene all2096 KCN HQNO inhibition of respiration
Schlagwörter
(Deutsch)
Cyanobakterien Anabaena sp. PCC 7120 Anabaena sp. Stamm PCC 7120 Nostoc PCC 7120 respiratorische terminale Oxidasen RTO Atmung Atmungsmessung Atmungsrate diazotrophes Wachstum ARTO Cox Cyd Ptox Cytochrom c Oxidase Alternative Respiratorische Terminale Oxidase Cytochrom bd-Typ Oxidase Plastidische Terminale Oxidase Gen all2096 KCN HQNO Inhibierung der Atmung
Autor*innen
Markus Mikulic
Haupttitel (Englisch)
Knock-out mutants of respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120
Paralleltitel (Deutsch)
Knock-out Mutanten respiratorischer terminaler Oxidasen im Cyanobakterium Anabaena sp. Stamm PCC 7120
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
168 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Georg Schmetterer
AC Nummer
AC11674233
Utheses ID
26095
Studienkennzahl
UA | 441 | | |