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Knock-out mutants of respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120

Markus Mikulic

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Chemie

Betreuer*in

Georg Schmetterer

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DOI

10.25365/thesis.29247

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30466.82684.378070-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Knock-out Mutanten respiratorischer terminaler Oxidasen im Cyanobakterium Anabaena sp. Stamm PCC 7120: Cyanobakterien sind Bakterien, die oxygene Photosynthese, mit dem Nebenprodukt O2, betreiben. Vorkommend in nahezu allen Habitaten der Erde, tragen sie 30 - 50 % zur globalen O2 Produktion bei. Sie können auch aerobe Atmung mit O2 als terminalen Elektronenakzeptor betreiben. Dieser Prozess wird von respiratorischen terminalen Oxidasen (RTO) katalysiert, die sich in der Thylakoid- oder Plasmamembran befinden. Die Cyanobakterienstämme unterscheiden sich voneinander in Anzahl und Typen der vorhandenen RTOs. In der Dunkelatmung wird während der Photosynthese aufgebautes Glykogen metabolisiert und ATP generiert. In Cyanobakterien finden die aerobe Atmung und die Photosynthese im selben Kompartiment statt, wobei wichtige Bestandteile der Elektronentransportkette, wie z. B. der Plastochinonpool, gemeinsam genutzt werden. Manche Cyanobakterien, wie der filamentöse Anabaena sp. Stamm PCC 7120 (PCC 7120), können in spezialisierten Heterozystenzellen N2 zu NH4 +, katalysiert durch die O2-sensitve Nitrogenase, reduzieren. RTOs in PCC 7120: 1) 3 Häm-Kupfer Oxidasen: * echte mitochondrial-Typ Cytochrom-c- Oxidase (Cox), essentiell für chemo-heterotrophes Wachstum; * 2 alternative, respiratorische, terminale Oxidasen (ARTO), teilweise homolog zu Cox, keine Cytochrom c Oxidierbarkeit, nur in Heterozysten. 2) Cytochrom bd-Typ Oxidase (Cyd): Katalysiert Elektronenübertragung von Chinon zu O2, möglicher Schutz des Chinonpools vor Überreduktion. 3) Plastidische terminale Oxidase (Ptox): Katalysiert Elektronenübertragung von Chinon zu O2, möglicher Schutz des Chinonpools vor Überreduktion, Sequenzähnlichkeit mit mitochondrialer, alternativer Oxidase (Aox). Für die Konstruktion einer ptox Mutante wurde der rekombinante Vektor pMMUV6, mit einer N- und Cterminalen Flankierungssequenz des ptox Gens all2096, disruptiert durch die Sm / Sp Resistenzkassette C.S3, in 3 Schritten hergestellt. Durch Konjugation mit E. coli wurde pMMUV6 in PCC 7120 transferiert. Die transformierten PCC 7120 wurden so kultiviert, dass auf homozygote Knock-out Mutanten selektiert wurde. Nun vorliegende PCC 7120 RTO Mutanten: cox-, ptox- (diese Arbeit), cox- ptox- (diese Arbeit), cyd-, cox2- cox3-, cox2- und cox3-. Die endogene Atmung der verschiedenen PCC 7120 Stämme wurde im Dunkeln mit der Clark Sauerstoffelektrode mit einer Zellsuspension von OD730 = 5 gemessen. Nach der Messung wurde der Chlorophyllgehalt der Zellsuspension bestimmt. Entgegen der Erwartung variierten die bestimmten Werte signifikant zwischen und innerhalb der verschiedenen RTO Mutanten und dem Wildtyp (Einheit: μg · ml-1 [OD730 = 5]): WT 16.6, cox- 21.2, ptox- 14.6, cox- ptox- 25.7, cyd- 11.9. Diese große Variation deutet darauf hin, dass die optische Dichte einer Zellsuspension filamentöser Cyanobakterien offensichtlich nicht mit der Zellzahl in der Suspension korreliert. Die mikroskopische Analyse des Wildtyps und der RTO Mutanten zeigte eine stammspezifische Filamentlänge, mit den meisten Wildtyp Filamenten aus 3 - 6 Zellen bestehend, während die Mutanten hingegen signifikant längere Filamente aufwiesen. Dies könnte der Grund für die großen Unterschiede im Chlorophyllgehalt sein. Folglich ist die bevorzugte und genaueste Maßeinheit für die Atmungsrate auf den Chlorophyllgehalt bezogen. Die Mittelwerte der endogenen Atmungsrate pro mg Chlorophyll (μmol O2 · h-1 · [mg Chlorophyll]-1) unterschieden sich signifikant zwischen den PCC 7120 Stämmen: WT 17.4, cox- 17.1, ptox- 25.0, cox- ptox- 13.0, cyd- 33.5. Die endogene Atmung war eine Reaktion 0. Ordnung und wurde durch die Zugabe von 50 mM Fruktose nicht gesteigert, obwohl PCC 7120 WT zu chemo-organohetertrophem Wachstum mit mehr als 50 mM Fruktose befähigt ist. Alle PCC 7120 RTO Mutanten zeigten klar erkennbare Atmungsaktivtät im Dunkeln. Dies zeigt, dass keine der RTOs essentiell für die Atmung ist. Eine deutlich erhöhte Atmungsrate zeigte sich bei der Cyd und der Ptox Knock-out Mutante. Die noch vorhandenen RTOs könnten hier den Verlust der anderen RTOs überkompensieren. Im Vergleich zum Wildtyp verändert der Verlust der Cox die Atmungsrate nicht signifikant. Inhibitoren der Zellatmung, die sich in früheren Arbeiten als für bestimmte RTOs spezifisch zeigten, wurden getestet: 0.67 mM KCN inhibierte die Atmungsaktivität von PCC 7120 WT komplett und die von cox- und ptox- um 97 - 98 %. PCC 7120 cox- ptox- mit der Cyd als einzig aktiver RTO war mit 95 % Inhibierung weniger KCN sensitiv. Auffallend ist, dass die Atmungsaktivität von PCC 7120 cyd- durch die Zugabe von 0.67 mM KCN sofort und komplett beendet wurde. Diese neue Entdeckung deutet darauf hin, dass nicht die Ptox, sondern die Cyd die RTO mit reduzierter KCN-Sensitivität in PCC 7120 ist. Die Inhibierung der Atmung durch 80 μM HQNO (2-Heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide) variierte sehr stark (Einheit: % relative Inhibierung der endogenen Atmungsrate): WT 26.0, cox- 39.6, ptox- 20.9, cox- ptox- 33.6, cyd- 32.3. Die Atmung von PCC 7120 cox- ptox- mit der Cyd als einzig aktiver RTO wurde nicht komplett durch HQNO inhibiert, im Gegensatz zu der Synechocystis sp. PCC 6803 RTO Mutante, in der die Cyd als einzig aktive RTO mit 50 μM HQNO komplett inhibierbar war. Keine der RTOs war für photoautotrophes Wachstum mit gebundenem Stickstoff und konstanter Beleuchtung essentiell. PCC 7120 cox- ptox- zeigte langsameres Wachstum und höhere Empfindlichkeit gegenüber Licht. Eine wichtige, neue Entdeckung ist, dass PCC 7120 cox-, cox- ptox- und cyd- nicht photoautotroph auf N2 wachsen können.

Abstract

(Englisch)

Knock-out mutants of respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120: Cyanobacteria are defined as bacteria performing oxygenic photosynthesis with O2 as by-product. Naturally occurring in nearly all habitats worldwide, they account for 30 - 50 % of the O2 production on earth. They can also perform aerobic respiration, where O2 functions as terminal electron acceptor. This process is catalysed by respiratory terminal oxidases (RTOs), located in the thylakoid membrane or the plasma membrane. The number and the different types of RTOs are very variable among the cyanobacterial strains. Dark respiration generates ATP mostly from glycogen produced in photosynthesis. In cyanobacteria, aerobic respiration and oxygenic photosynthesis occur in the same compartment, sharing major components of the electron transport chain, like the PQ pool. Some cyanobacteria, such as filamentous Anabaena sp. PCC 7120 (PCC 7120) can reduce N2 to NH4 + in specialised cells called heterocysts, catalysed by the highly O2- sensitive enzyme nitrogenase. RTOs of PCC 7120: 1) 3 heme copper oxidases: * Genuine mitochondrial-type cytochrome c oxidase (Cox), essential for chemo-organoheterotrophic growth; * 2 alternate respiratory terminal oxidases (ARTO): Partly homologous to Cox, no cytochrome c oxidation, only expressed in heterocysts. 2) Cytochrome bd-type oxidase (Cyd): Catalyses electron flow from quinol to O2, may prevent PQ pool from over-reduction. 3) Plastidic-type oxidase (Ptox): Catalyses electron flow from quinol to O2, may prevent PQ pool from over-reduction, has sequence similarities with mitochondrial alternative oxidase (Aox). For the construction of a PCC 7120 ptox mutant, recombinant vector pMMUV6, containing the N-terminal and C-terminal flanking sequences of the ptox gene all2096 disrupted by the Sm / Sp resistance cassette C.S3, was constructed in 3 steps. By conjugation with E. coli, pMMUV6 was transferred into PCC 7120. The transformed PCC 7120 were cultivated to select for homozygous ptox knock-out mutants. Now available homozygous PCC 7120 RTO mutants: cox-, ptox- (this work), cox- ptox- (this work), cyd-, cox2- cox3-, cox2- and cox3-. The endogenous respiration of the different PCC 7120 strains was measured in the dark with a Clark oxygen electrode with a cell suspension of OD730 = 5. After the measurement, the chlorophyll content of the cell suspension was determined. Contrary to the expectation, the determined values varied significantly between and within the different RTO mutant strains and the wild type (units are μg · ml-1 [OD730 = 5]): wt 16.6, cox- 21.2, ptox- 14.6, cox- ptox- 25.7, cyd- 11.9. This big variation indicates that the optical density of a cell suspension with filamentous cyanobacteria is apparently not well correlated with the number of cells in the suspension. The microscopic analysis of wild type and mutant cultures showed a strain specific variation in filament length, with most of the wild type filaments having a length of only of 3 - 6 cells, whereas the mutant strains mostly had significant longer filaments. This may have caused the big variations in chlorophyll content. Hence, the preferred and most accurate measurement unit of the respiratory rate is related to the chlorophyll content. The mean values of the endogenous respiratory rate per mg chlorophyll (μmol O2 · h-1 · [mg chlorophyll]-1) varied significantly between the different strains: wt 17.4, cox- 17.1, ptox- 25.0, cox- ptox- 13.0, cyd- 33.5. The endogenous respiration was a reaction of zero order and was not enhanced by the addition of 50 mM fructose, although PCC 7120 wt was capable of chemoorganoheterotrophic growth with more than 50 mM fructose. All PCC 7120 RTO mutants showed a clearly detectable respiratory activity in the dark. Hence, none of the RTOs is essential for respiration. The knockout of the Ptox or Cyd resulted in significantly higher endogenous respiratory rates. The remaining RTOs may overcompensate the loss of one of these RTOs. The loss of the Cox did not alter significantly the endogenous respiratory rate compared to the wild type. Respiratory inhibitors that were shown to be specific for particular RTOs in previous works were tested: 0.67 mM KCN inhibited the respiratory activity of PCC 7120 wt completely and that of cox- and ptox- to about 97 - 98 %. PCC 7120 cox- ptox-, with the Cyd as sole active RTO, was a little less sensitive with 95 % inhibition. Remarkably, the respiratory activity of PCC 7120 cyd- was completely and instantly inhibited by the addition of 0.67 mM KCN, indicating that the Cyd and not the Ptox of PCC 7120 is the RTO with a reduced KCN sensitivity. The inhibition rates of respiration by 80 μM HQNO (2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide) varied significantly (units are % relative inhibition of endogenous respiratory rate): wt 26.0, cox- 39.6, ptox- 20.9, cox- ptox- 33.6, cyd- 32.3. In PCC 7120 cox- ptoxthe Cyd as only active RTO was not completely inhibitable by HQNO, whereas in a Synechocystis sp. PCC 6803 RTO knock-out mutant the Cyd as sole active RTO was completely inhibited by 50 μM HQNO. In PCC 7120 none of the RTOs was essential for photoautotrophic growth with combined nitrogen and constant light. PCC 7120 cox- ptox- showed a lower growth rate and was also more susceptible to light. The inability of PCC 7120 cox-, cox- ptox- and cyd- to grow photoautotrophically without combined nitrogen is a novel discovery.

Autor*innen

Markus Mikulic

Haupttitel (Englisch)

Knock-out mutants of respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120

Paralleltitel (Deutsch)

Knock-out Mutanten respiratorischer terminaler Oxidasen im Cyanobakterium Anabaena sp. Stamm PCC 7120

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

168 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Georg Schmetterer

Klassifikationen

35 Chemie > 35.22 Physikalische Chemie: Sonstiges ,

35 Chemie > 35.72 Bioenergetik ,

35 Chemie > 35.73 Biochemische Reaktionen ,

42 Biologie > 42.12 Biophysik ,

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,

42 Biologie > 42.30 Mikrobiologie

AC Nummer

AC11674233

Utheses ID

26095

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter