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The impact of PIP2 on neurotransmitter transporter mediated substrate flux
Tina Hofmaier
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Harald Sitte
DOI
10.25365/thesis.29318
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29081.71305.990359-7
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Serotonin zählt neben Dopamin u. Noradrenalin zu den wichtigsten Neurotransmittern im menschlichen Gehirn. Eine strikte Regulation von Serotonin (5-HT) ist essentiell um Prozesse wie Schlaf, Stimmung, Antrieb und Gedächtnis zu steuern. Neben Synthese u. Transmission von Serotonin zählt Wiederaufnahme von 5-HT zu den wichtigsten regulatorischen Prozessen, welche über den Serotonin Transporter (SERT) bewerkstelligt wird. Selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer inhibieren SERT u. unterstreichen damit seine dominante Rolle in psychiatrischen Erkrankungen wie Depression, Angststörung und Persönlichkeitsstörung. Jedoch ist wenig über die genauen Regulationsmechanismen von SERT bekannt. Diese Arbeit untersucht den Einfluss eines wichtigen Membranlipids, Phosphoinositol-2-Phosphat (PIP2), auf die Funktion von SERT. Unter Verwendung eines heterologen Expressionssystem konnte gezeigt werden, dass eine drastische Reduktion von PIP2 zu einer Reduktion in SERT-Efflux führen wobei die Influx-Raten unverändert bleiben. Eine Reduktion von PIP2 konnte über die Aktivierung der Proteinkinase C (PLC) mittels der Substanz m-3M3FBS erreicht werden, wobei ausgeschlossen werden konnte, dass PLC selbst zu einer Verminderung des SERT-Efflux beiträgt. Demnach konnte gezeigt werden, dass PIP2 SERT mit großer Wahrscheinlichkeit via direkter Interaktion reguliert. Mögliche Positionen an welchen diese Interaktion stattfinden könnte wurden mittels bioinformatischer Analysen ermittelt. Zwei Aminosäurereste K352 (Helix6) und K460 (Helix 9) kamen aufgrund ihrer Position und Ladung in Frage. In einem nächsten Schritt wurden beiden Aminosäuren mutiert. Die Untersuchung dieser K352A/K460A hSERT Doppelmutante bestätigte unsere Annahme insofern als dass Efflux Raten in der Mutante erniedrigt waren, Influx Raten sich jedoch unbeeinflusst im Vergleich zum Wildtyp hSERT zeigten. Damit konnte gezeigt werden, dass PIP2 den Flux von SERT selektiv moduliert indem es nur den Efflux beeinflusst, jedoch nicht den Influx. Diese Modulation geschieht höchstwahrscheinlich durch eine direkte Bindung von PIP2 an die Aminosäurereste K352 und K460 von hSERT.
Abstract
(Englisch)
The serotonin transporter (SERT) as a member of the sodium-coupled neurotransmitter transporters (NSS) plays a crucial role in the termination of serotonin signalling. Alterations of intrinsic transporter function and regulation are associated with psychiatric diseases and physiological disorders. A great deal of effort has been taken to unravel SERT regulation and transport mechanism. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) is involved in several major cellular regulatory processes and was also shown to play a role in the regulation of integral membrane proteins, like ion channels (Gamper and Shapiro, 2007a). PIP2 as well as cholesterol have been found to be enriched in membrane microdomains where also SERT was found to be located and regulated (Chang et al., 2012). Nevertheless, a regulatory effect of PIP2 on SERT fluxes has never been investigated before. This work examined the role of PIP2 on SERT transport flux by using a heterologous expression system. It could be shown that the PLC activator m-3M3FBS was able to deplete PIP2 in HEK-hSERT cells resulting in reduced amphetamine-induced efflux rates but unchanged ligand influx. To preclude the possibility that observed reduction of efflux rates is caused by activation of second messengers due to cleavage of PIP2 via PLC, inhibition of PIP2 synthesis via the substance PAO was investigated. Indeed, the same reduction in efflux but without affecting influx rates could be demonstrated which verified that this effect was caused by PIP2 depletion rather than via activation of second messengers. These results indicate that PIP2 directly effects amphetamine induced transporter efflux indicating that this could be mediated via direct binding of PIP2 to SERT. Computational analysis revealed two positively charged amino acids K352 (helix 6) and K460 (helix 9), located in the intracellular loops of SERT, as potential binding sites for PIP2. Mutagenesis of both amino acids did not alter intrinsic transporter function but displayed the exact same effect as was observed for PIP2 depletion. K352A/K460A double mutation in hSERT did affect neither substrate influx nor trafficking to the surface, but was shown to markedly reduce amphetamine induced efflux rates. Therefore it could be demonstrated that PIP2 modulates SERT flux selectively, by only affecting efflux and that this modulation occurs most likely via direct binding of PIP2 to the amino acids K352 K460.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
neurotransmitter transporter PIP2 substrate flux
Schlagwörter
(Deutsch)
Neurotransmitter Transporter PIP2 Substrat Efflux
Autor*innen
Tina Hofmaier
Haupttitel (Englisch)
The impact of PIP2 on neurotransmitter transporter mediated substrate flux
Paralleltitel (Deutsch)
Der Enfluss von PIP2 auf den Neurotransmitter Transporter mediiertern Substrat Fluss
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
65 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Seiser
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC11678616
Utheses ID
26155
Studienkennzahl
UA | 490 | | |