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Co-application of bone morphogenetic protein 2 and osteogenic medium enhances osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in 2D and 3D culture

Alice Zimmermann

Art der Arbeit

Masterarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Johannes Nimpf

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DOI

10.25365/thesis.29330

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29418.30599.160969-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Einleitung: Knochenmorphogenetische Proteine (bone morphogenetic proteins, BMPs) sind sezernierte Polypeptide, die als Homo- oder Heterodimer vorliegen können und zur multifunktionellen TGF-ß Familie (Wachstum, Proliferation, Differenzierung) gehören. Ihr hohes osteoinduktives Potential, besonders von BMP2 und BMP7, wurde schon oft in diversen Studien in vitro und in vivo gezeigt. Dieses kann nur in Kombination mit einem geeigneten Biomaterial, welches eine lang anhaltende kontinuierliche Freisetzung ermöglicht, völlig ausgeschöpft werden. Hierfür wurde in meiner Arbeit Fibrin eingesetzt, da es ein natürlich vorkommendes biokompatibles Polymer ist. Ziele: Das Ziel dieser Studie war es, das Differenzierungspotential von BMPs in 2D und 3D zu untersuchen, sowie die Eignung von Fibrin als osteogenes Biomaterial in Kombination mit mesenchymalen Rattenstammzellen aus Fettgewebe (rat adipose-derived stem cells, rADSCs) zu testen. Methoden: Die 4-wöchige Wachstumsfaktor- und Plasmid-induzierte osteogene Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen wurde in 2D durch eine spezifische Kalzium-Färbung, quantitative RT-PCR und ELISA untersucht. In 3D erfolgte der Nachweis mittels Lichtmikroskopie sowie RT-PCR. Ergebnisse: Die Expressionen der osteogenen Marker Osteokalzin, alkalische Phosphatase und Sialophosphoprotein I waren in BMP2/7 transfizierten Zellen im Vergleich zu GFP transfizierten Zellen erhöht. Diese Zellen zeigten eindeutig den Einfluss eines osteogenen Mediums auf die Differenzierung, indem dieses eine Osteocalcin- und SPP-Expression in allen Proben herbeiführte. Ein BMP2 ELISA konnte die osteogen stimulierende Wirkung dieses Mediums bestätigen. Zuletzt konnte in 2D nachgewiesen werden, dass ein BMP2/7-Plasmid eine hohe Osteoinduktivität besitzt, jedoch das Differenzierungspotential erheblich eingeschränkt ist, wenn ein osteogenes Medium mit 300 ng rhBMP2 im Einsatz ist. Weiters wurden die gemessenen Werte mit einer Alizarin-Rot Färbung bestätigt, eine Färbung, die vorhandene Kalziumablagerungen in Osteozyten rot einfärbt. In Folge wurde der Einfluss eines Fibrinklots auf die osteogene Differenzierung von Fettstammzellen in 3D Kultur mit quantitativer RT-PCR untersucht. Es konnte mittels RT-PCR nachgewiesen werden, dass rADSCs in einem osteogenen Medium eine besonders hohe Expression von Osteokalzin und Sialophosphoprotein haben, wenn sie mit 300 ng rhBMP2 behandelt werden. Diese Beobachtung bekräftigt die Resultate in 2D, wobei in 3D eine vielfache Expression dieser osteogenen Marker gemessen werden konnte. Interessanterweise wurde in allen Fibrinklots eine einheitliche Kollagen Typ I Expression vorgefunden, worauf zu schließen ist, dass wahrscheinlich in allen Proben bereits eine optimale Dichte des Kollagengrundgerüsts (für die Ablagerungen von knochenspezifischen Proteinen) im Rahmen der Osteogenese erreicht wurde.

Abstract

(Englisch)

Backround: Bone morphogenetic proteins (BMPs) are secreted polypeptides that appear as homo- or heterodimer and belong to the multifunctional TGF-ß family (growth, proliferation, differentiation). Their high osteoinductive potential, particularly of BMP2 and BMP7, has been proved to be successful in bone formation in vitro and in vivo. Due to the fact that a suitable biomaterial can enhance BMPs’ bone forming activity by a continuous long-term plasmid release, fibrin, a natural derived biocompatible polymer was used as 3D scaffold for mesenchymal stem cells in this study. Objectives: The aim of the study was to analyse the differentiation potential of BMPs as recombinant growth factor and as gene therapy approach in 2D and 3D, as well as to examine the suitability of fibrin as osteogenic biomaterial for rat adipose-derived stem cells (rADSCs). Methods: The growth factor and plasmid-induced osteogenic differentiation (4 weeks) in 2D was verified by a specific calcium staining (Alizarin-Red staining), quantitative RT-PCR for specific osteogenic markers and BMP2 ELISA. The effect of fibrin as biomaterial on differentiation was analysed by quantitative RT-PCR for osteogenic markers and light microscopy. Results: Expression levels of osteocalcin, alkaline phosphatase and sialophosphoprotein I were up regulated in BMP2/7 transfected cells compared to reporter gene transfected (GFP positive) cells. Further, the presence of an osteoinductive medium was clearly sufficient to induce osteocalcin and sialophoshoprotein in all samples. A BMP2 ELISA confirmed the impact of this medium on osteogenic differentiation. Last, it could be determined in 2D that a BMP2/7 heterodimer has a high osteoinductive potential on rADSCs, which was however not visible in combination with the osteogenic medium or therapeutic protein. These results were verified by alizarin-red staining, a staining that colours mineral deposits red. In the next step the impact of fibrin clots on osteogenic differentiation of rADSCs in 3D was determined by quantitative RT-PCR. At mRNA level, rADSCs cultured in an osteogenic medium show an especially high osteocalcin and sialophosphoprotein expression, if they are treated additionally with 300 ng rhBMP2. This observation is consistent with results in 2D, but reaches a remarkably high level of up regulation in 3D. Interestingly, a uniform expression level of collagen type I was detected in all samples. Probably, a definite amount of collagen fibers has already be produced in the fibrin clots for following differentiation and deposition of specific osteogenic proteins.

Autor*innen

Alice Zimmermann

Haupttitel (Englisch)

Co-application of bone morphogenetic protein 2 and osteogenic medium enhances osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in 2D and 3D culture

Paralleltitel (Deutsch)

Ko-Applikation von knochenmorphogenetischem Protein 2 und osteogenem Medium verstärkt die osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in 2D und 3D Kultur

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

89 S.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Johannes Nimpf

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC11677281

Utheses ID

26167

Studienkennzahl

UA | 066 | 834 | |

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Schlagwörter