Detailansicht
Expression and Refolding of human GPCRs for NMR Studies
Daniel Mayer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Gebhard Schertler
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30452.21264.224265-7
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) gehören zu den Membranproteinen und sind zu einem erheblichen Anteil an den Signalübertragungen, vom extrazellulären in den intrazellulären Raum, beteiligt. Sie sind an vielen wichtigen regulatorischen Prozessen in der Zelle involviert. Des Weiteren werden ihre Fehlfunktionen mit einer großen Anzahl an Krankheiten in den Zusammenhang gebracht, wie zum Beispiel: Entstehung vom Krebs, kardiale Dysfunktion, Störungen des zentralen Nervensystems, Übergewicht, Entzündungen und Schmerz. Etwa ein Drittel aller derzeit auf dem Markt verfügbaren Medikamente wirken auf diese Rezeptoren. Um ein besseres Verständnis über ihre Funktion auf molekularer Ebene zu erhalten, ist es sehr wichtig, ihre Struktur und Dynamik zu kennen. Derzeit stellt NMR die beste und am weitesten entwickelte Technik dar um die Dynamik von Proteinen zu erforschen. Für NMR Untersuchungen ist es jedoch notwendig isotopenmarkierte Proteine zu expremieren, was jedoch oft ein Problem darstellt. E. coli ist das am besten etablierte Expressionssystem und ermöglicht eine Vielzahl an unterschiedlichen Isotopenmarkierungen. In dieser Arbeit gelang es zwei humane GPCRs erfolgreich in Milli-grammmengen zu expremieren. Die verwendeten GPCRs sind zum Einen der Wildtyp des menschlichen Vasopressin V2 Rezeptors (V2R) und zum Anderen eine stabilisierte Version des menschlichen β1-Adrenergic Rezeptors (beta1AR-FB1). Des Weiteren war es möglich ein Protokoll für die Aufreinigung rekombinant hergestellter Proteine zu etablieren, welches ausgezeichnete Ausbeuten und eine hohe Reinheit lieferte. In weiterer Folge wurde ein Rückfaltungsprotokoll entwickelt, das einen small-scale Screen verschiedenster Rückfaltungsbedingungen erlaubt. Die verschiedenen Rückfaltungsprodukte wurden mit folgenden Methoden charakterisiert: Temperaturstabilitätsassay, Radio-Ligand Binding Test, Massenspektrometrie, Gel-Permeations-Chromatographie und Analytische Ultrazentrifuge. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Rückfaltungsstrategie ein vielversprechender Ansatz für das weitere Forschungsprojekt darstellt. Mit ein paar wenigen weiteren Optimierungen lassen sich höchstwahrscheinlich vielversprechenden Proben für zukünftige NMR-Studien produzieren.
Abstract
(Englisch)
G-protein-coupled receptors (GPCRs) are membrane proteins which sense a variety of extracellular stimuli and transmit the signal into the cell. They are responsible for the controlling of many important functions in the organism, and their malfunction is associated with a number of diseases such as including cancer, cardiac dysfunction, central nervous system disorders, obesity, inflammation and pain. They are targeted by approximately a third of currently used drugs. In order to understand how GPCRs function at molecular level, we need to know their structure and dynamics. NMR is most powerful and established technique to study dynamics of proteins. To do NMR measurements, proteins need to be labelled with NMR-active isotopes. E. coli is the most widely and versatile expression system to produce labelled proteins. I have expressed the human GPCRs wild-type version of vasopressin V2 receptor (V2R) and a stabilised version of β1-adrenergic receptor (beta1AR-FB1) in E. coli in inclusion bodies in milligram amounts. A purification protocol was established which delivered high yields and purity of unfolded GPCRs. In order to develop a refolding protocol, I have designed a small-scale screen and identified initial refolding conditions. I characterised the refolded samples by stability measurements, radio-ligand binding assay, mass spectrometry, size-exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation. The results suggest that the refolding strategy is a promising approach, and with additional optimisation will result in samples suitable for NMR studies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
GPCRs V2R beta1AR NMR refolding GPCRs G-Protein-coupled receptors
Schlagwörter
(Deutsch)
GPCRs V2R beta1AR NMR Rückfaltung G-Protein gekoppelte Rezeptoren
Autor*innen
Daniel Mayer
Haupttitel (Englisch)
Expression and Refolding of human GPCRs for NMR Studies
Paralleltitel (Deutsch)
Expression und Rückfaltung humaner GPCRS für NMR Studien
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
67 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Gebhard Schertler
Klassifikationen
35 Chemie > 35.79 Biochemie: Sonstiges ,
42 Biologie > 42.99 Biologie: Sonstiges
AC Nummer
AC11019076
Utheses ID
26204
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |