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Elemental labeling of antibody fragments for LC-ICP-MS based immunoassays
Teresa Mairinger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Regina Krachler
DOI
10.25365/thesis.29703
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30322.00730.413263-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Derivatisierung von Antikörpern mit elementmarkierten Liganden und deren Detektion mittels hochempfindlicher induktiv gekoppeltes Plasma Massenspektrometrie bietet die Möglichkeit zur indirekte Quantifizierung unterschiedlicher Analyten in biologischen und biomedizinischen Fragestellungen (z.B.: Krebs-Biomarker oder zelluläre Metabolite). Diese Art der Detektion findet beispielsweise Anwendung bei Immunoassays mit absoluter Quantifizierung in biologischen Proben. Die zu analysierenden Proben zeichnen sich durch eine komplexe Matrix, ein begrenztes Probenvolumen und niedrige Konzentrationen des Analyten (z.B. ein Biomarker) aus. Daher ist die Entwicklung von hochempfindlichen, selektiven und robusten Quantifizierungsstrategien erforderlich.
Ziel dieser Masterarbeit war die Entwicklung einer Markierungsmethode für ein gentechnisch verändertes Antigen bindendes Fragment (Fab), ein sogenannter ThioFab (Junutula JR et al. 2008), mit einem Elementlabel, bestehend aus dem Makrozyklus DOTA und einem Lanthanid als Chelation. Die Messung erfolgte über Flüssigkeitschromatographie kombiniert mit induktiv gekoppeltes Plasma-Massenspektrometrie (LC-ICP-MS).
Zum ersten Mal wurde eine Markierungsmethode für einen ThioFab mit einem Elementlabel entwickelt. Der Einsatz dieses ThioFabs, welcher ein rekombinant eingeführtes Cystein trägt, ermöglicht ein einfaches Labelingprozedere. Durch diesen eingeführten Cysteinrest ist lediglich ein milder Reduktionsschritt vor der Umsetzung mit dem Elementlabel Lanthanoid-DOTA-Maleimid, notwendig. Dadurch kommt es zu keiner Fragmentierung des ThioFabs und daher zur Beibehaltung der hohen Selektivität des Fab.
Die Optimierung der Markierungsmethode wurde einerseits im Hinblick auf die Koordinierung des ausgewählten Lanthanids durch den Komplexbildner DOTA und andererseits bezüglich der Reaktion des Komplexes mit dem ThioFab, durchgeführt. Vorversuche wurden mit humanem Serum Albumin als Modellprotein durchgeführt. Durch die Anwendung der optimierten Markierungsmethode wurde der Markierungsgrad des gentechnisch veränderten ThioFab von 0.4% auf 40% erhöht.
Als Proof of Concept wurde die Bildung des ThioFab/ Antigen Konjugates mit Anti-Her2/ Her2 als Modellsystem erfolgreich gezeigt.
Abstract
(Englisch)
The derivatisation of antibodies with elemental labels and their ICP-MS based detection offers the possibility for indirect quantification of various targets (e.g. cancer markers or cellular metabolites). This straight-forward technique is applicable for e.g. immunoassays via ICP-MS based absolute quantification of the targets in biological samples. As the assessed samples are characterized by a complex matrix, limited sample volume and low concentrations of the analyte (e.g. a biomarker), quantification requires highly sensitive, selective and robust strategies.
The aim of this master thesis was the development of a labeling procedure for a genetically modified antigen binding fragment (Fab), so-called ThioFab (Junutula JR et al. 2008), with rare earth element label macrocycles, and its analysis via liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry (LC-ICP-MS).
For the first time a labeling procedure for a ThioFab with lanthanide label macrocycles was developed. The employment of this ThioFab, which carries an additional recombinantly introduced cysteine, allows a straight-forward labeling. Due to this introduced cysteine residue, only a mild reduction step, prior to the attachment of the elemental label lanthanide-DOTA-maleimid, was necessary and therefore no fragmentation was obtained.
The optimization of the labeling procedure was performed in terms of coordination of selected lanthanides by the complexing moiety and the linking reaction of the complex to the ThioFab. Pre-optimization steps were performed with human serum albumin as model protein. By applying the optimized labeling procedure the labeling degree of the genetically modified ThioFab increased from 0.4% to 40%.
As a proof of concept the formation of the final ThioFab/ antigen conjugate employing Anti-Her2/ Her2 as model system was successfully demonstrated.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Labeling Elemental labeling antibody fragments genetically modified antigen binding fragment ThioFab inductively coupled plasma mass spectrometry absolute quantification Immunoassay
Schlagwörter
(Deutsch)
Markierung Elementlabel Antikörper Fragmente genetisch verändertes Antigen bindendes Fragment ThioFab induktiv gekoppeltes Plasma Massenspektrometrie absolute Quantifizierung Immunoassay
Autor*innen
Teresa Mairinger
Haupttitel (Englisch)
Elemental labeling of antibody fragments for LC-ICP-MS based immunoassays
Paralleltitel (Deutsch)
Markierung von Antikörper Fragmenten mit einem Elementlabel für LC-ICP-MS basierende Immunoassays
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
65 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Regina Krachler
AC Nummer
AC11708732
Utheses ID
26483
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |