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Inherent characteristics of the dsDNA binding dyes EvaGreen®, Sybr® Green and SYTO® 9 in multiplexed PCR setups
Georg Mair
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Ralf Steinborn
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29283.90123.907855-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Hintergrund
Interkalierende Farbstoffe werden routinemäßig zur “Echtzeit”-Darstellung der
Sequenzamplifikation (z.B. basierend auf der PCR) verwendet. Aufgrund der Tatsache, dass
diese Moleküle mit allen doppelsträngigen Nukleotidketten interagieren können, ermöglichen
sie zusätzlich den Nachweis der spezifisch und unspezifisch amplifizierten Produkte mittels
der Definition von Temperaturcharakteristika durch eine Schmelzkurven-Analyse. Dadurch
können mit berechneten Temperaturunterschieden verschiedene Produkte differenziert
werden. Dies jedoch nur unter der Voraussetzung, dass eine homogene Verteilung der
Farbstoffmoleküle erfolgte. Dieser Voraussetzung stehen unter anderem sequenz- oder
nukleotid-spezifische Bindungspräferenzen der Farbstoffe entgegen, kontraproduktive
Attribute, die für den qPCR-Standardfarbstoff SG mehrfach beschrieben wurden. Für die
neuen Moleküle der 3ten und HRM-fähigen Generation stehen derartige Informationen wie
im Fall von EG nur rudimentär zur Verfügung. Das Ziel dieser Arbeit war daher, die
Leistungsfähigkeit der Farbstoffe EG, SG und SYTO9 für den Nachweis von verschiedenen
Zielsequenzen mit MCA zu überprüfen. Dafür wurden vorrangig das Saturierungspotenzial,
Bindungspräferenzen sowie die Zahl der von einer Sequenz gebundenen Farbstoffmoleküle
untersucht. Ein zusätzlicher Versuchsansatz hob schließlich die unterschiedliche Interaktions-
Kinetik der ausgewählten Farbstoffe mit dissoziierenden und re-assoziierenden DNASequenzen
hervor.
Methoden
Die Leistungsfähigkeit der Farbstoffe EG und SG wurde in erster Instanz mit einem im Labor
etablierten qPCR-MCA Multiplex-Ansatz, einem speziellen Genotypisierungs- und einem
Ansatz zum Nachweis eines GC-reichen und sekundärstruktur-bildenden Amplifikats
untersucht. Die weiteren Fragestellungen, wie das Saturierungspotenzial oder
Bindungspräferenzen wurden mit einer Vielzahl von Produkten getestet. Die Dissoziation und
Hybridisierung wurde mit zwei Sequenzen, die laut POLAND-Software energetisch
unterschiedliche Bereiche aufwiesen, sowie mit Sequenzen unterschiedlichen GC Gehalts
verglichen
Ergebnisse und Diskussion
Die Multiplex-Analyse mittels qPCR-MCA war nur möglich mit EG, nicht aber mit SG. Als
wahrscheinliche Erklärung dieses Versagens zeigte sich nicht die übliche Konzentration,
sondern die hohe GC-Affinität von SG. Diese Präferenz verstärkt unter anderem die
thermische Stabilität von möglichen Sekundärstrukturen und schränkte die Amplifikation
einer GC-reichen Zielsequenz (Pou3f1) sowie die Reproduzierbarkeit bi-allelischer SNPGenotypisierung
mit SG massiv ein. EG konnte als einzigem Farbstoff kein basenspezifisches
Bindungverhalten nachgewiesen werden. Gefundene Unterschiede wurden auf
die unterschiedlichen Elektronenwolken von AT- und GC-reichen Sequenzen zurückgeführt.
Dieser moderatere Einfluss ermöglichte damit Multiplex-Analysen im Gegensatz zu SG.
Im Zuge dieser Experimente zeigte sich weiters, daß die gemessenen Schmelztemperaturen
unterschiedlicher DNA-Sequenzen von berechneten Tm-Werten abwichen (ΔTm > 2.5 °C).
Dies konnte den Einflüssen von Reaktionskomponenten zugeordnet werden, die die
Dissoziation der Stränge verzögern und nicht wie MgCl2 in Berechnungen eingebunden sind.
Die Messung der Fluoreszenzänderung während der Reassoziierung von Einzelsträngen
ermöglicht dagegen eine zeitlich bessere Abfolge, da die Komponenten erst nach dem
Zusammenschluss binden können. Die mit dieser alternativen Analyse gemessenen
unterschieden sich kaum von den berechneten Tm-Werten (ΔTm < 0.6 °C).
Abstract
(Englisch)
Background
Intercalating dyes are commonly used for qPCR setups. If bound to double-stranded targets,
they allow real time monitoring of amplification and closed-tube revision of targeted and coamplified
products by Melting Curve Analysis (MCA). In case of a homogenous dye
distribution, the method allows multiplexing of two or more targets with different Tms.
Contrary to the gold standard dye SybrGreen (SG), for which a GC content directed binding
preference is assumed, such effects are not scrutinised for the more recently developed 3rd
generation and HRM capable dye EvaGreen (EG) or other equivalent dyes. Therefore this
study aimed at elaborating the performance of the dyes EG, SG and SYTO9 regarding the
potential to saturate two targets, binding preference to nucleotides and the binding frequency
to a sequence. Additionally hybridisation protocols were performed to characterise the
different kinetics of the dyes interacting with dissociating and re-associating amplicons.
Methods
An in-house multiplex qPCR-MCA assay was used in addition to a single reaction genotyping
approach and an assay to amplify a severely structured GC-rich amplicon to investigate the
performance of EG and SG. The potential of saturation and sequence dependent binding
patterns were traced with setups of defined template copy numbers. The comparison of
amplicon melting and hybridisation was done with various sequences of different GC content
and two sequences for which two melting domains were predicted with the heat map
prediction tool POLAND.
Results and Discussion
Parallel detection of two targets multiplexed in one reaction was possible with EG contrary to
SG. In case of an amplicon with high GC content SG even caused inhibition of the PCR or
false genotyping results. Employing setups of defined template copy numbers with different
GC content, however, identified that the recommended concentration of SG but not the
recommended concentration of the HRM compatible dyes EG or SYTO9 was sufficient to
saturate two targets. Regarding the binding preferences, it was shown that SG preferred GCrich
sequences contrary to SYTO9, while such an attribute was avoided for EG. A preferred
interaction type was identified as intercalation for SG or assumed for S9 and related to their
binding preference. Such distinct kinetics were not identified for the homogenously
performing EG. Reduced fluorescence maxima of the GC-rich amplicon peaks were due to
quenching effects caused by the dimeric structure of this dye and the sequence moieties. Dye
molecule relocation was only possible with S9. The comparison of the melting and
hybridisation protocols identified a higher concurence of the latter regarding the
thermodynamics of the dye / sequence interaction as the predicted melting temperatures (Tm)
only matched the temperature values in re-associating amplicons.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
dsDNA binding dyes melting curve analysis multiplexed PCR setups melting point calculation qPCR
Schlagwörter
(Deutsch)
Farbstoffe Schmelzkurvenanalyse multiplex PCR Ansätze Schmelzpunktbestimmung qPCR
Autor*innen
Georg Mair
Haupttitel (Englisch)
Inherent characteristics of the dsDNA binding dyes EvaGreen®, Sybr® Green and SYTO® 9 in multiplexed PCR setups
Paralleltitel (Deutsch)
Inherente Eigenschaften der an doppelsträngige DNS bindenden Farbstoffe EvaGreen®, Sybr® Green und SYTO® 9 in multiplex PCR Ansätzen
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
51 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Ralf Steinborn
AC Nummer
AC11060100
Utheses ID
26575
Studienkennzahl
UA | 441 | | |