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Tool development and behavioural analysis to investigate the influence of light on platynereis dumerilii behaviour
Heinrich Oberlerchner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Kristin Tessmar-Raible
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29866.99918.654870-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Fortpflanzung zu maximieren müssen
Meereslebewesen mit äußerer Befruchtung den Zeitpunkt der Paarung synchronisieren.
Beim Borstenwurm Platynereis dumerilii kommt es zu einer Schwarmbildung, während der
viele reife Würmer zugleich ihre Gameten abgeben. Dieses Schwärmen tritt immer nachts
neun bis dreizehn Tage nach Vollmond auf. Dies kann auch im Labor mit einem künstlichen
Mondzyklus beobachtet werden. Außerdem ist dieser Organismus nachtaktiv, um während
der Futtersuche nicht so leicht von Fressfeinden entdeckt zu werden. Um den korrekten
Zeitpunkt für die nächste Eiablage bzw. die korrelierenden geophysikalischen Ereignisse
vorhersagen zu können und rechtzeitig mit der Metamorphose zum reifen Stadium zu
beginnen brauchen Organismen innere Uhren. Die Tagesuhr besteht aus gewissen Genen
die oszillieren und an die Lichtschwankungen des Tagesrhythmus (circadiane Uhr) oder des
Mondzyklus (circalunare Uhr) gewöhnt werden, die Oszillation wird auch fortgeführt, wenn
der äußere Einfluss nicht mehr da ist. Um die Lichtveränderungen zu erkennen besitzt
Platynereis zwei Photorezeptorsysteme basierend auf Opsinen: den rhabdomerischen
Lichtrezeptor und den ciliären Lichtrezeptor. Diese Arbeit versucht die Funktion dieser
beiden Lichterkennungssysteme im Zusammenhang mit den beiden Uhren, die in Platynereis
arbeiten, herauszufinden. Dabei wurde versucht ciliäre Photorezeptorzellen mit einem GFPReporterkonstrukt
zu markieren, was auch gelang, jedoch konnten keine einheitlichen
Ergebnisse erzielt werden. Die Generation von Antikörpern schlug fehl. Weiters konnte auch
kein stabiler transgener Stamm etabliert werden. „Transcription activator like effector
nucleases“ oder kurz TALENs sind Konstrukte um gezielte Mutationen hervorzurufen. Solche
mit c-Opsin als Ziel wurden mit Hilfe des Golden Gate Klonverfahrens erzeugt und in vitro
auf Funktionalität und Spezifität getestet. Allerdings konnten in vivo keine Mutationen
gefunden werden. Es wurde auch eine Methode entwickelt um das Verhalten von Platynereis
dumerilii zu studieren. Dafür wurde mit Hilfe eines Kamerasystems die Würmer beobachtet
und Arten von Verhalten definiert und kategorisiert und diese dann aufgezeichnet. Die
entstandenen Graphen bestätigten vorherige Studien über das nachtaktive Verhalten des
Organismus. Weitere Experimente wurden dann unter verschiedenen Lichtbedingungen und
Mondphasen gemacht. Diese zeigten dass das circadiane Verhalten von Platynereis unter
Kontrolle einer Uhr steht, aber auch von der circalunaren Uhr beeinflusst wird, da das
Verhalten bei Vollmond stark verändert ist, auch wenn dieses Signal einmal nicht gegeben
wird. In einem ähnlichen Experiment wurde untersucht wie sich der Verlust von
rhabdomerischen Photorezeptorzellen, diese werden durch chemische Ablation abgetötet,
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auf den Tagesrhythmus von Platynereis auswirkt. Drei Tage nach Behandlung mit der
Chemikalie war kaum noch eine signifikante Rhythmik vorhanden, was auf eine Rolle dieses
Photorezeptors hinweist. Zusammenfassend kann man sagen, dass ich eingeschränkten
Erfolg hatte ciliäre Photorezeptorzellen zu markieren und c-Opsin zu mutieren, allerdings war
es mir möglich eine Verhaltensanalyse zu etablieren und mit Hilfe dieser, eine mögliche
Rolle von r-Opsin beim Einstellen der Tagesrhythmik gefunden habe.
Abstract
(Englisch)
Marine organisms that rely on external fertilisation need to synchronize their spawning to
ensure successful mating. The organism Platynereis dumerilii exhibits such swarming events
where numerous individuals mature and spawn at the same time. This is not only connected
to daytime, but also to the lunar cycle, both resembling light signals. Swarming takes place
nine to thirteen days after full moon, which could also be observed under culture conditions
by mimicking the moon cycle artificially. Secondly this organism is only active during the
night, meaning searching for food only occurs during darkness to avoid predators. To
anticipate the correct time to spawn or feed and or the correlating geo-physical events
respectively an internal timing mechanism called “clock” is evolutionary advantagous. A clock
is entrained by environmental signals which provoke an oscillation of certain genes, which
still continues even if the entrainment signal is not available for some time.
Platynereis possesses two photoreceptor systems based on opsins: the rhabdomeric type
and the ciliary type, which could sense light as entrainment signal for the two different clocks.
This study attempts to reveal if and how these two different systems contribute to
entrainment of the worm’s biological clocks. Therefore tools to visualize the photoreceptive
cells and mutate the photoreceptor genes have been established. Labelling of ciliary
photoreceptor cells with a GFP reporter construct was successful, although results were
contradicting (and we were unsuccessful to develop an functional antibody) and no stable
transgenic line was created. Transcription activator like effector nucleases (TALENs) as a
tool to induce mutations were assembled with help of Golden Gate cloning in a fashion that
they target ciliary opsin. Successful and specific cleavage of the target sequence could be
demonstrated in vitro, but no mutations were observed in vivo. At last a method to observe
and analyse the behaviour of Platynereis dumerilii was established to investigate the output
stage of a biological rhythm. By using a camera system and defining and categorizing types
of behaviour and scoring them, activity plots were created, thereby confirming previous
studies about the nocturnal activity of Platynereis. After verifying the reliability of this
approach behaviour was analysed under different light conditions and during different moon
phases. Results of those experiments suggest that circadian behaviour of Platynereis is
driven by the circadian clock, but the circalunar clock seems to have an impact on it, as
during full moon the behaviour is severely altered. These alterations have also been
observed without an external signal and hence are under clock control. Locomotor activity of
worms that lost all their rhabdomeric photoreceptor cells because of chemical ablation has
been analysed in a similar fashion. Three day after drug treatment the investigated animals
showed no significant rhythmicity anymore, hinting an important role of this photoreceptor. In
summary I had limited success in labelling ciliary photoreceptors and creating a method to
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mutate c-opsin, but I was able to use a behavioural assay which revealed a possible role of ropsin
in maintaining circadian rhythmicity and the influence of the circalunar clock on it.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
ciliary photoreceptors rhabdomeric photoreceptors circadian rhythm circalunar rhythm transgenesis mutagenesis with TALENs Platynereis dumerilii
Schlagwörter
(Deutsch)
ciliäre Photorezeptoren rhabdomerische Photorezeptoren circadianer Rhythmus circalunarer Rhytmus Transgenese Mutagenese mit TALENs Platynereis dumerilii
Autor*innen
Heinrich Oberlerchner
Haupttitel (Englisch)
Tool development and behavioural analysis to investigate the influence of light on platynereis dumerilii behaviour
Paralleltitel (Deutsch)
Methodenentwicklung und Verhaltensanalyse um den Einfluss von Licht aus das Verhalten von Platynereis dumerilii zu Untersuchen
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
58 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Kristin Tessmar-Raible
AC Nummer
AC11060115
Utheses ID
26576
Studienkennzahl
UA | 441 | | |