Detailansicht
Isolation, oxidative folding and ion-channel modulation of plant cyclotides
Martin Auer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Hannes Todt
DOI
10.25365/thesis.29813
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30082.72703.433665-9
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Cyclotide sind cyclische Pflanzenpeptide welche im Pflanzenreich sehr weit verbreitet sind. Sie besitzen eine charakteristische 3D Struktur welche durch drei hoch konservierte disulfid Brücken hervorgerufen wird. Diese drei disulfid Brücken werden auch „cyclic cystine – knot (CCK)“ genannt und verleihen den Cyclotiden besondere Stabilität. Im Vergleich zu linearen Peptiden sind Sie zum Beispiel stabil gegen hohe Temperaturen und proteolytischen Verdau welche in einer guten oralen Bioverfügbarkeit resultieren. Typischer weise bestehen Sie aus 28 – 31 Aminosäuren und haben ein Molekulargewicht zwischen 2500 – 4000 Da. Weiters sind Sie eher hydrophob wodurch sie an einer RP-HPLC Säule relativ spät eluieren. Grundsätzlich unterscheidet man Cyclotide in 2 Untergruppen, Bracelets Cyclotide und Möbius Cyclotide. Rund 2/3 der bekannten Cyclotide gehören zur Untergruppe der Bracelets.
Entdeckt wurden Cyclotide vor ca. 40 Jahren durch ethnobotanische Untersuchungen an der Pflanze Oldenlandia affinis, welche im Kongo von Eingeborenen benutzt wurde um Wehen einzuleiten. Als Wirkstoff in dieser Pflanze wurde das cyclische Peptid kalata B1 identifiziert, welches das Erste und bis heute am Meisten untersuchte Cyclotid ist. Bis jetzt wurden Cyclotide in 36 Spezies in den Violaceae, Rubiaceae, Apocynaceae, Cucurbitaceae und Fabaceae entdeckt. Viele dieser Peptide zeichnen sich durch ihre Bioaktivität aus, wie z.B.: anti-HIV, anticancer, insektizid, antimikrobiell, haemolytisch und immunsuppressive.
Die Gewinnung dieser Peptide ist bis jetzt durch die Zeit und arbeitsintensive Isolierung und Aufreinigung aus den entsprechenden Pflanzen limitiert. Obwohl es auch möglich ist, Cyclotide chemisch zu synthetisieren, ist diese Synthese durch die anschließende Faltung in die native Struktur limitiert. Während die oxidative Faltung von Möbius Cyclotiden schon sehr fortgeschritten ist und man eine sehr hohe Ausbeute (>90%) an nativem Peptide erreicht, ist die Faltung von Bracelet Cyclotiden sehr komplex und schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Faltungsbedingungen für die beiden Bracelet Cyclotide cycloviolacin O2 und vigno 10 sowie für das Möbius Cyclotide kalata B1 Mutante [T20K]kalata B1 zu optimieren. Obwohl verschiedene Faltungsbedingungen analysiert wurden, ist es nicht gelungen cO2 und vigno 10 mit zufriedenstellenden Ausbeuten zu falten. Die höchste erzielte Ausbeute für cO2 betrug ~27% natives Peptide und für vigno 10 ~4%. Das Möbius Cyclotide [T20K]kalata B1 konnte allerdings mit einer Ausbeute von 95% erfolgreich gefalten werden.
Die kalata B1 Mutante [T20K]kalata B1 zeigte in vorangegangenen Studien eine immunsuppressive Wirkung, der genaue Mechanismus der dieser Wirkung zu Grunde liegt ist bis heute unbekannt (Gründemann et al., 2013). Eine weitere Studie fand heraus, dass ein strukturell ähnliches Peptid, welches auch eine immunsuppressive Wirkung aufweist, den Spannungs-regulierten Kaliumkanal Kv1.3 blockiert (Gurrola et al., 2012). Dieser spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung und dadurch der Proliferation von T – Lymphozyten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen ob das immunsuppressive Cyclotide [T20K]kalata B1 den Kaliumkanal Kv1.3 inhibieren kann und dadurch die Proliferation der T – Lymphozyten inhibiert. Mehrere Messungen haben aber leider ergeben, dass dieses Peptid nicht mit dem Kv1.3 interagiert. Viel mehr hat sich gezeigt, dass es ab einer Konzentration von 4µM zelltoxisch wirkt und zu einer langsamen Auflösung der Zellmembran führt.
Abstract
(Englisch)
Cyclotides are an abundant class of plant peptides containing a head – to –tail cyclic backbone and three highly conserved disulfide bonds, together known as cyclic cystine-knot (CCK) motif. The CCK motif confers them with remarkable stability. Compared to linear peptides they are stable against high temperatures and proteolytic degradation resulting in good bioavailability. The typically comprise about 28-31 amino acids in size, which leads to a typical mass range of 2500-4000 Da. Furthermore they are rather hydrophobic which results in the typically late elution from a RP-HPLC column. Mainly two subfamilies of cyclotides have been described in the literature so far, Möbius and bracelet – type peptides. Almost 2/3 of the known cyclotides belongs to the subfamily of the bracelets cyclotides.
The discovery of cyclotides based on the ethno botanical investigations of Lorents Gran on the plant Oldenlandia affinis 40 years ago. This plant was used from indigenous woman to induce labor. As active compound, kalata B1 was identified, hence it was the first and so far the best analysed cyclotide. So far, 36 species in the Violaceae, Rubiaceae, Apocynaceae, Cucurbitaceae and Fabaceae have been discovered. For several cyclotides different bioactivities are reported such as, anti-HIV, antitumor, insecticidal, antimicrobial, haemolytic and immunosuppressive.
Since the availability of the cyclotides is limited and dependent the extraction from native plant material, the development of efficient strategies for chemical synthesis and oxidative folding of cyclotides will be very crucial. Whereas the folding of Möbius cyclotides is far advanced, it is possible to achieve yields >90%, the folding of bracelet cyclotides remains still difficult and complex. The aim of this study was to optimize the folding conditions for the bracelet cyclotides cycloviolacin O2 and vigno 10 as well as the Möbius cyclotide kalata B1 mutant [T20K]kalata B1. Although different folding conditions were tried, it was not possible to fold cO2 and vigno10 with a satisfying yield. The highest yield which was achieved for cO2 was ~27% native peptide and for vigno 10 ~4%. The Möbius cyclotide [T20K]kalata B1 was successfully folded with a yield of 95%.
In a previous study it was shown that the kalata B1 mutant [T20K]kalata B1 has an immunosuppressive effect, but the exactly mechanism remain unclear. (Gründemann et al., 2013) Another study figured out that an structural related peptide which shows also an immunosuppressive effect, blocks the voltage gated potassium channel Kv1.3 which plays a crucial role in the activation and hence the proliferation of T cells. The second aim of this study was to determine if the cyclotide [T20K]kalata B1 can block the potassium channel Kv1.3. Unfortunately, several measurements showed that [T20K]kalata B1 doesn´t interact with the Kv1.3 channel. Furthermore it was shown that 4µM [T20K]kalata B1 is cell toxic and leads to a slowly disruption of the cell membrane.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Cyclotides oxidative folding [T20K]kalata B1 Kv1.3
Schlagwörter
(Deutsch)
Cyclotide oxidatives Falten [T20k]kalata B1 Kv1.3
Autor*innen
Martin Auer
Haupttitel (Englisch)
Isolation, oxidative folding and ion-channel modulation of plant cyclotides
Paralleltitel (Deutsch)
Isolierung, oxidative Faltung und Ionen-Kanal modulation von pflanzlichen Cyclotiden
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
I, 95 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Hannes Todt
AC Nummer
AC11708756
Utheses ID
26581
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |