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Functional characterization of human allergen-specific T-cell receptors in vitro and in vivo
Alina Neunkirchner
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Winfried Pickl
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29704.58114.596464-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
T-Lymphozyten spielen in der Pathogenese von allergischen Erkrankungen eine zentrale Rolle. Während der Sensibilisierungsphase führt die Allergen-Exposition des respiratorischen Epithels zur Differenzierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APZ), welche die Aktivierung von allergen-spezifischen T-Lymphozyten begünstigen.
Um die Beteiligung von T-Zellen an allergischen Reaktionen zu analysieren, wurde die "Allergen-spezifische Synapse" auf molekularer Ebene rekonstruiert. Zu diesem Zweck wurden die notwendigen Moleküle, welche für die Antigen-Präsentation (i.e. HLA-Moleküle) sowie für die Antigen-Erkennung (i.e. α- und β-Kette des T-Zellrezeptor (TZR)) für das Hauptallergen des Beifusspollens (Art v 1, Artemisia vulgaris) und für das Hauptallergen des Birkenpollens (Bet v 1, Betula verrucosa), verantwortlich sind, kloniert. In diesem Zusammenhang hat sich die transiente Transfektion von 293 Zellen mit den allergenen Peptiden, den dazugehörigen HLA-Molekülen sowie unterschiedlichen kostimulatorischen Molekülen als eine zuverlässige Methode zur Erzeugung von APZ erwiesen. Des Weiteren haben wir die Tatsache genutzt, dass durch die genetische Übertragung der spezifischen TZR α- und β-Ketten einer allergen-spezifischen T-Zelle die Antigen-Spezifität von dieser T-Zelle auf eine andere übertragen werden kann. Tatsächlich konnten wir beobachten, dass die Übertragung der beiden allergen-spezifischen TZR auf eine humane T-Zelllinie bzw. auf T-Zellen aus dem peripheren Blut von allergischen und nicht allergischen Individuen dazu führte, dass die solcherart hergestellten transgenen T-Zellen die Spezifität des ursprünglichen T-Zellklons annahmen (i.e. Allergen-Spezifität, Kreuzreaktivität mit homologen Allergenen). Die Aktivierung der transgenen T-Zellen war dabei, vergleichbar mit dem ursprünglichen T-Zellklon, strikt abhängig vom Vorhandensein eines kostimulatorischen Zweitsignals. Die solcherart erwirkte Rekonstruktion der Allergen-spezifischen Synapse ermöglichte uns, unterschiedlichste Strategien zu entwickeln und zu testen, um pathogene Allergen-spezifische T-Zell Antworten zu verändern oder aber ganz zu inhibieren. Eine Hypothese besagt, dass allergische Erkrankungen aus einem Ungleichgewicht zwischen den beiden T-Helferzelltypen Th1 und Th2 hervorgehen und daher allergische Reaktionen auf ein Überwiegen von Th2-Antworten zurückzuführen wären. Aus diesem Grund haben wir untersucht, ob APZ, welche das immundominante T-Zell-Epitop von Bet v 1 präsentieren und gleichzeitig Membran-gebundenes IL-12 auf der Zelloberfläche exprimieren, Bet v 1-spezifische TZR tg T-Zellen zu IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen polarisieren können. Wir haben in Kokultur Experimenten gefunden, dass diese Th1-polarisierten T-Zellen tatsächlich die Effektorfunktionen von Allergen-spezifischen Th2-Zellen zu inhibieren vermögen.
Eine weitere Untergruppe der CD4+ T-Zellen stellen natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (Treg) dar, welche eine wichtige Rolle im Rahmen der Induktion und Aufrechterhaltung von immunologischer Toleranz spielen. Das Vorhandensein von Treg wäre eine mögliche Erklärung dafür, warum in der Vergangenheit nicht alle experimentellen und klinischen Beobachtungen in der Allergieforschung restlos durch ein Ungleichgewicht zwischen Th1- und Th2-Zellen erklärt werden konnten. Daher haben wir uns hier auch die Frage gestellt, ob sich CD4+ T-Zellen, welche mit Genen transduziert werden, die mit der Treg Funktion assoziiert sind und die für allergen-spezifische TZR kodieren, zu Allergen-spezifischen Treg entwickeln würden. Mit Hilfe eines multicistronischen Vektors, der ein IRES-GFP Reporter Element trägt wurde der Bet v 1-spezifische TZR mit FOXP3, dem Hauptregulatorgen für die Treg Funktion kombiniert. Tatsächlich führte die retrovirale Transduktion von CD4+CD25- T-Zellen aus dem peripheren Blut mit dem mulitcistronischen Expressionskonstrukt zur Ausbildung von TZR+FOXP3+ T-Zellen, welche einen regulatorischen Phänotyp und regulatorische Funktion aufwiesen. Die solcherart hergestellten Bet v 1-spezifischen TZR+FOXP3+ T-Zellen ließen sich sowohl durch Allergen-spezifische als auch durch polyklonale Stimulation nur schwer zum Wachstum anregen (hyporesponsiv), waren aber dazu im Stande, die Effektorfunktion und die Proliferation von Allergen-spezifischen T-Zellen in aktivierungsabhängiger Form zu hemmen.
Für die detaillierte Untersuchung von Allergen-spezifischen T-Zellen und um neue Therapiemodelle für humanrelevante Aero-Allergene in vivo zu etablieren, haben wir doppelt transgene Mäuse erzeugt, welche neben dem Art v 1-spezifischen TZR auch das dazugehörige humane Restriktionselement HLA-DR1 exprimieren. Im ersten Schritt wurde eine umfangreiche immunologische Charakterisierung der verschiedenen Maus-Linien vorgenommen (Wildtyp, Einzeltransgen, Doppelttransgen). Die Untersuchungen haben klar gezeigt, dass Splenozyten von doppelt transgenen Mäusen (TZR/DR1) spezifisch sowohl mit dem immun-dominanten Art v 125-36-Peptid als auch mit dem Art v 1-Gesamtprotein reagierten. Im Gegensatz dazu zeigten weder die Splenozyten von Wildtyp-Mäusen noch jene von einfach transgenen Mäusen (TZR oder DR1) Wachstum nach Inkubation mit Art v 1 Protein oder Peptid. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Zytokin-Produktion beobachtet. Die in vivo-Evaluierung der verschiedenen Maus-Gruppen hat nun gezeigt, dass nach aerogener Sensibilisierung mit dem Allergen nur doppelt transgene Mäuse eine erhöhte Atemwegs-Reaktivität nach neuerlicher Exposition mit Allergen aufwiesen. Tatsächlich waren drei aufeinander folgende Expositionen mit dem vernebelten Allergen ausreichend, um eine stark veränderte Atemwegsfunktion in den TZR/DR1 Mäusen zu erzielen, welche von starken Entzündungszeichen der Atemwege und der Lunge begleitet wurden. Die solcherart behandelten Tiere wiesen eine massive Akkumulation von inflammatorischen Immunzellen in den bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten auf, welche von starken peribronchiolären und perivaskulären entzündlichen Infiltraten der Lungen begleitet wurden. Trotz der starken pathologischen Veränderungen, war in diesen Tieren keine Allergen-spezifischen Immunglobuline (weder IgE noch IgG) nachweisbar.
Humane Allergen-spezifische TZR stellen vielversprechende Werkzeuge zur Entwicklung von neuartigen immunmodulatorischen Strategien in der Allergieforschung dar. In diesem Sinne, werden die in dieser Arbeit erstmals hergestellten human-relevanten Allergiemodelle einen entscheidenden Beitrag zum besseren Verständnis von allergischen Erkrankungen und zur Entwicklung effizienterer Therapien leisten.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Allergie T-Zellen T-Zellrezeptor Immunmodulation
Autor*innen
Alina Neunkirchner
Haupttitel (Englisch)
Functional characterization of human allergen-specific T-cell receptors in vitro and in vivo
Paralleltitel (Deutsch)
Funktionelle Charakterisierung von humanen allergen-spezifischen T-Zellrezeptoren in vitro und in vivo
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
193 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Winfried Pickl
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11061003
Utheses ID
26604
Studienkennzahl
UA | 091 | 441 | |