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Establishment of a suitable multilocus sequence analysis procedure for determining the diversity of Vibrio cholerae strains in Lake Neusiedler See
Carina Pretzer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Angela Witte
DOI
10.25365/thesis.29927
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29259.48547.459061-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Vibrio cholerae ist ein natürlicher Bestandteil aquatischer Ökosysteme aber auch ein humanpathogenes Bakterium, das besonders in Entwicklungsländern wo sauberes Trinkwasser nicht verfügbar und Hygienestandards mangelhaft sind, Ausbrüche bis hin zu Epidemien verursachen kann.
V. cholerae ist der Erreger der lebensbedrohlichen Krankheit Cholera die bei einer Dunkelziffer von 100.000 Toten jährlich rangiert von denen nur ein Bruchteil der WHO gemeldet werden. Die Pathogenität von V. cholerae basiert hauptsächlich auf der Expression der Virulenzgene ctx und tcp. Nach der Aufnahme von mit Vibrio cholerae kontaminiertem Wasser oder fester Nahrung sind die Bakterien mithilfe des „Toxin Coregulated Pilus“ (TCP) in der Lage das Epithel des Dünndarms zu besiedeln. Die Produktion von Cholera Toxin (CTX) führt zu einer pathologischen Veränderung des Ionen Haushalts. Das hat wässrigen Durchfall zur Folge, der unbehandelt zum Tod führen kann. Von den derzeit 200 bekannten Serogruppen von V. cholerae sind jedoch nur zwei, O1 und O139, Auslöser der endemischen Cholera. Vertreter der anderen Serogruppen werden zusammengefasst als nicht-O1/nicht-O139, und können Durchfallserkrankungen mit milderem Verlauf, sowie Wund-, Ohr- oder Blutinfektionen auslösen.
In den Jahren 2000 bis 2005 traten in Österreich 13 Infektionen durch nicht-O1/nicht-O139 V. cholerae auf - für fünf davon wurden Aufenthalte am Neusiedler See belegt. Die Patienten litten an Mittelohrentzündung, Entzündungen des äußeren Ohres und einer tödlich verlaufenden Sepsis eines immunsupprimierten Fischers. Aufgrund dieser Vorkommnisse wurde 2001 ein Monitoringprogramm gestartet um die Ökologie, genetische Diversität und potentielle Pathogenität von V. cholerae zu erfassen. In einer späteren Studie wurden mittels Pulsfeldgelelektrophorese 84 Vibrio cholerae Isolate zu 64 unterschiedlichen Genotypen differenziert.
Die sich aufwerfenden Fragen nach der genetischen Diversität von V. cholerae im See wurden nun in dieser Studie mit einer Multilocus Sequenz Analyse beantwortet. Beruhend auf dem Vergleich der DNA-Sequenz ausgewählter, langsam evolvierender Haushaltsgene, wird durch minimale Allelvariationen Auskunft über die Zusammensetzung der Population gegeben. Hierfür wurden 299 Isolate von drei repräsentativen Habitaten gesammelt, kultiviert und mittels ompW Polymerasekettenreatkion als Vibrio cholerae identifiziert. Vier Haushaltsgene plus ein Virulenzgen und die dazugehörigen Primer wurden basierend auf vorangegangenen Studien ausgewählt, die spezifischen Polymerasekettenreaktionen entwickelt und schließlich 1500 Amplifikate produziert. Weiters wurden 8 klinische V. cholerae Isolate und vier O1 Referenzsequenzen mit in die Studie aufgenommen. Die Amplifikate wurden zur kommerziellen Sequenzierung verschickt, die erhaltenen Sequenzen manuell kontrolliert, zusammengehörende Vorwärts- und Rückwärtssequenzen zusammengefügt, die Sequenzen eines Locus auf gleiche Länge zugeschnitten, die vier Gen-Fragmente eines Isolats zu einer Sequenz verkettet und alle 311 Sequenzen mittels der Programme „MEGA“ und dem „MUSCLE“- Algorithmus „aligned“ - ausgerichtet. Für die phylogenetische Analyse wurde mit dem Programm „MrBayes“ das Markov-Chain-Monte-Carlo-Verfahren angewendet. Mittels „MrBayes“ und „DnaSP“ konnten Details der einzelnen Loci berechnet und verglichen werden.
Die errechneten Phylogramme ließen erkennen, dass rpoA nicht zur Differenzierung verschiedener Vibrio cholerae herangezogen werden kann. Das Phylogramm basierend aus den Sequenzen der verketteten vier Gen-Fragmente schlüsselte die V. cholerae Population der drei untersuchten Habitate auf und deckte 41 unterschiedliche Haplotypen auf, wobei 40 % aller Isolate nur einem einzigen Haplotyp zugeordnet wurden und 60 % der Isolate 40 verschiedenen Haplotypen angehörten. Das Habitat Schilfgürtel wies die höchste Diversität an unterschiedlichen Vibrio cholerae auf. 20 der aufgedeckten Haplotypen waren einzigartig für diesen Standort und nur ein einziger Haplotyp war spezifisch für den Probenpunkt „Intermediäres Habitat“ und keiner für den Probenpunkt „Offener See“. Die verbleibenden 20 unterschiedlichen V. cholerae Haplotypen kamen an allen drei Probenstellen vor. Manche miteinbezogene klinische V. cholerae Isolate wurden zu den Seeisolaten gruppiert und zeigten so, dass die krankheitsauslösenden V. cholerae Stämme aus früheren Jahren (2008-2011) 2012 noch immer im See vorhanden waren. Beim Vergleich des erstellten Multi-Locus-Phylogramms mit den Einzel-Loci-Phylogrammen wird deutlich, dass die Genfragmente toxR, recA und gyrB den meisten Einfluss hatten und außerdem einige deutlich weiter entfernte, unterschiedlichere, Isolat-Konstellationen bewirkten, die im Multi-Locus Phylogramm übernommen wurden.
Um die innerartliche Vielfalt der V. cholerae im See abzuschätzen, wurden „Rarefaction“-Kurven erstellt, welche ergaben, dass die Zahl der analysierten Isolate ausreichte um die Vibrio cholerae Population in drei unterschiedlichen Habitaten des Neusiedler Sees zu erfassen.
Abstract
(Englisch)
Vibrio cholerae is a natural inhabitant of aquatic ecosystems and a human pathogen causing the acute life-threatening diarrhoeal disease cholera. The pathogenesis of V. cholerae is mainly based on the expression of the virulence genes ctx and tcp. Mediated by the toxin co-regulated pili (TCP) ingested V. cholerae can colonize the epithelium of the small intestine where production of cholera toxin (CTX) disrupts the ion transport followed by a watery diarrhoea which leads to death if not treated. However, only the two serogroups O1 and O139 out of 200 serogroups are able to cause epidemic cholera. All other serogroups, collectively named non-O1/non-O139, are associated with mild to severe watery diarrhoea, or wound, ear and blood infections.
In Austria, 13 infections with non-O1/non-O139 which caused otitis media or otitis externa and also one lethal sepsis were reported between 2000 and 2005; five of them were associated with Lake Neusiedler See. In 2001 a surveillance program was started to observe the ecology, genetic diversity and potential pathogenicity of V. cholerae by Kirschner and colleagues. A previous genotyping approach based on pulsed-field gel electrophoresis identified 64 different genotypes out of 84 isolates of Lake Neusiedler See which fostered further investigations of the genetic diversity of Vibrio cholerae in the lake.
In this study, the genetic diversity of V. cholerae in three habitats of Lake Neusiedler See was assessed after establishment of a suitable multilocus sequence analysis (MLSA) procedure. 300 V. cholerae isolates were collected from three different habitats in the lake. These isolated presumptive V. cholerae were confirmed as V. cholerae by detection of a specific V. cholerae outer membrane protein – ompW – via PCR. Additionally, 8 clinical isolates of Vibrio cholerae and four O1 reference strains were included. For the MLSA four housekeeping genes, gyrB, recA, pyrH, rpoA and one virulence-associated gene, toxR, were chosen, based on the research of recent literature. The used primer sequences for PCR based gene amplification originated from different previous analyses. For accurate amplification, different PCR conditions, like variations in annealing temperature or primer concentration, were successively tested, and the amplified PCR products sequenced at a commercial sequencing facility. The obtained sequences were manually processed. They were first checked for quality, forward and reverse sequences were assembled, trimmed to equal length, concatenated and finally aligned by the program “Muscle”. For phylogenetic analysis, Metropolis-coupled Markov-chain-Monte-Carlo sampling was done by the program “MrBayes” and nucleotide properties and some specific details of the phylogenetic analysis of the different loci were computed by “MrBayes” and “DnaSP”. This analysis showed that toxR contributed 50 % of the parsimony informative sites of the concatenated sequences, and the number of polymorphic sites in this locus was double compared to the other loci. The computed phylograms revealed that locus rpoA wasn’t applicable for differentiation of environmental Vibrio cholerae isolates.
Nevertheless, MLSA of the concatenated sequence set of the remaining four loci resolved the V. cholerae population in the three different habitats of Lake Neusiedler See in detail and revealed 41 clades of environmental V. cholerae with different distributions within the three different habitats. 40 % of all isolates were grouped together to one haplotype of V. cholerae which occurred more frequently in the open water and the intermediate habitat, and the remaining 60 % of the environmental samples were separated into 40 different haplotypes. The diversity of V. cholerae strains in the reed belt was twice as high compared to open water and the intermediate habitat. 20 of the revealed haplotypes were unique for the habitat “reed belt”, while in the intermediate habitat only a single unique haplotype occurred and no one was unique for “open water”. The remaining 20 different haplotypes were distributed in all three habitats. Interrelation of clinical isolates with the environmental isolates of the lake revealed that V. cholerae strains which were causing diseases in earlier years (2008-2011) were still present in the lake in 2012. By comparing the concatenated tree with the single loci trees it was obvious that toxR, recA and gyrB mainly affected the concatenated tree and caused some very distant clades concordant with the concatenated tree. For another comparison of Vibrio cholerae diversity between the different habitats, the parsimony informative sites within the habitats were compared.
To estimate the intra-species richness of Vibrio cholerae in the lake, rarefaction curves were generated, indicating that the number of isolates analysed was sufficient to depict the diversity of Vibrio cholerae in the different habitats of Lake Neusiedler See.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
bacteria Vibrio cholerae Neusiedler See Multilocus sequencing MLSA phylogenetics
Schlagwörter
(Deutsch)
Bakterien Vibrio cholerae Multi locus sequencing MLSA Phylogenie
Autor*innen
Carina Pretzer
Haupttitel (Englisch)
Establishment of a suitable multilocus sequence analysis procedure for determining the diversity of Vibrio cholerae strains in Lake Neusiedler See
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung eines geeigneten Multi Locus Sequencing Verfahrens um die Diversität von Vibrio cholerae im Neusiedler See zu bestimmen
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
84 S. : Ill., graph. Darst., Kt.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Angela Witte
AC Nummer
AC11067949
Utheses ID
26690
Studienkennzahl
UA | 441 | | |