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Establishment of a validated osteogenic MSC reporter line for optimization of osteogenic differentiation
Martin Fröhlich
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Rainer Prohaska
DOI
10.25365/thesis.29932
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29611.21873.104860-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Während meiner Diplomarbeit habe ich ein Protokoll für die Isolierung und Expansion von MSCs aus der Wharton-Sulze etabliert. Die daraus isolierten Zellen wurden anhand der Kriterien der International Society for Cellular Therapy charakterisiert. Hierfür wurde die Expression von mesenchymalen Antigenen mittels Durchflusszytometrie bestimmt und die Multipotenz durch erfolgreiche Differenzierung in Adipozyten, Chondrozyten, und Osteoblasten nachgewiesen. Für die Herstellung der Reportervektoren wurde von mir eine Methode für die Ligation von Promoter-Regionen in einen lentiviralen Signalweg-Reporter-Vektor entwickelt. Mit dieser Methode war es möglich, die Promoter-Regionen von fünf verschiedenen Osteoblasten-spezifischen Genen (ALPL, COL1A1, SPP1, BGLAP und SP7) in den lentiviralen Vektor zu ligieren.
Die so erzeugten Reportervektoren wurden mittels lentiviralen Gentransfers in das Genom der MSCs eingeschleust. Nach der Transduktion wurden die stabil transduzierten Zellen mit Puromycin selektioniert und anschließend in Adipozyten, Chondrozyten, und Osteoblasten differenziert. Wir waren nicht in der Lage zufriedenstellende Ergebnisse durch Messung der GFP Expression zu erzielen, jedoch konnte das Ausmaß der osteogenen Differenzierung durch Messung der Luciferase-Aktivität in Zelllysaten bestimmt werden. Die besten Ergebnisse wurden mit den SPP1 und COL1A1 Reportervektoren erzielt. In MSCs, die mit diesen Reportervektoren transduziert wurden, konnte eine hohe Luciferase-Expression schon nach 6 Tagen osteogener Differenzierung nachgewiesen werden, welche bis Tag 15 noch weiter anstieg. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die Luciferase Expression während der osteogenen Differenzierung höher war als während der adipogenen und chondrogenen Differenzierung.
Abstract
(Englisch)
During the diploma thesis a protocol for the isolation and expansion of mesenchymal stem cells from umbilical cord Wharton’s jelly was established. The isolated cells were then characterized according to the criteria proposed by the International Society for Cellular Therapy. Therefore, the expression of mesenchymal markers was determined by flow cytometry, and multipotency of the isolated cells was demonstrated by successful differentiation into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes. For the generation of the reporter constructs, I established a method for the ligation of promoter regions into a lentiviral pathway reporter vector. With this method, I was able to ligate the promoter regions of five osteogenic marker genes (ALPL, COL1A1, SPP1, BGLAP, and SP7) into the lentiviral reporter vector.
The reporter constructs were introduced into the genome of MSCs using lentiviral gene transfer. After the transduction, stably transduced cells were selected with puromycin and differentiated into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. While we couldn’t achieve satisfactory results with the measurement of GFP reporter expression because of the high autofluorescence of osteogenically differentiated cells, we were able to detect osteogenic differentiation through measurement of the luciferase activity in cell lysates. The best results were obtained with the SPP1 and COL1A1 promoter constructs. A high expression of luciferase was detected in cells transduced with these reporter constructs already after 6 days of osteogenic differentiation, and the expression further increased until day 15. In addition, we demonstrated that the luciferase expression was higher during osteogenic differentiation than in chondrogenic or adipogenic differentiation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
mesenchymal stem cells differentiation lentiviral reporter vectors flow cytometry molecular cloning PCR
Schlagwörter
(Deutsch)
Mesenchymale Stammzellen Differenzierung Lentivirale Reportervektoren Durchflusszytometrie Molekulare Klonierung PCR
Autor*innen
Martin Fröhlich
Haupttitel (Englisch)
Establishment of a validated osteogenic MSC reporter line for optimization of osteogenic differentiation
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung einer validierten osteogenen MSC Reporterlinie für die Optimierung osteogener Differenzierung
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
140 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Rainer Prohaska
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC11734819
Utheses ID
26695
Studienkennzahl
UA | 490 | | |