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Investigating directionality of genome release from human rhinovirus A 2

Katharina Huszar

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Dieter Blaas

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DOI

10.25365/thesis.30117

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29326.02602.145769-3

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Vermehrung von Viren ist von einer Wirtszelle abhängig. Humane Rhinoviren (HRVs) vermehren sich vorzugsweise in Epithelzellen des oberen Atmungstraktes, sie sind die Ursache für circa 50% an milden Infektionen des oberen Respirationstraktes. Rhinoviren setzen sich aus einem RNA-Genom und einer schützenden Proteinhülle (Capsid) zusammen. Diese Arbeit konzentriert sich auf den Vorgang des Genomtransfers. Wenn HRV den Rezeptor einer Wirtszelle bindet wird es durch Endozytose in die Zelle aufgenommen. In die Zelle aufgenommene Vesikel werden angesäuert, dieser Abfall des pH-Wertes induziert Konformationsänderungen des Capsids. Dadurch werden Poren in der Hülle geöffnet und das Genom wird entlassen. Die Proteinhülle ist aus sich wiederholenden Untereinheiten zusammengesetzt, die sich gleichzeitig umorganisieren. Das bewirkt ein simultanes Öffnen einer Vielzahl an Poren. Das Ziel dieser Arbeit war herauszufinden ob das Genom durch eine oder mehrere Poren entlassen wird. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob es eine bestimmte Richtung gibt mit der der Ausstoß der RNA erfolgt. Ist ein bestimmtes Ende dafür vorgesehen zuerst in die Wirtszelle zu gelangen? Um Antworten auf diese Fragen zu erhalten wurden zwei chemische Methoden angewandt. Bei der einen Methode (SHAPE) modifiziert eine Chemikalie RNA am 2´OH, aber nur dann, wenn das betreffende Nucleotid nicht in Sekundär- oder Tertiärinteraktionen involviert ist. Es gibt verschiedene Chemikalien, die RNA auf diese Art modifizieren, einige davon mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit. Aufgrund dieser hohen Reaktionsgeschwindigkeit ist eine Momentaufnahme des Transfers möglich, des Weiteren gibt die Methode Aufschluss darüber, ob die RNA einzel- oder doppelsträngig das Capsid verlässt. Modifikationen sind ein Hindernis für das Enzym Reverse Transcriptase, wenn modifizierte RNA in cDNA umgeschrieben wird, bricht die cDNA Synthese bei Modifikationen ab. cDNA Fragmente verschiedener Länge erlauben Rückschluss auf die Zugänglichkeit für die Chemikalie – doppelsträngige und vom Capsid geschützte RNA sollte nicht reagieren. cDNA Fragmente unterschiedlicher Länge werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt. Um die Analyse mittels eines ABI PRISM®310Genetic Analyzers zu ermöglichen mussten Änderungen an der Methode vorgenommen werden, wodurch die Auswertung der Daten mit dem dafür vorgesehenen Computerprogramm verhindert wurde. Ein alternatives Programm konnte die Daten ebenfalls nicht auswerten. Die zweite Methode basiert auf der Vernetzung von Proteinen und RNA durch Formaldehyd. Formaldehyd reagiert sowohl mit Aminosäuren als auch mit den Basen von Nucleinsäuren. Wenn die Pore um die herausragende RNA herum oder sogar mit der austretenden RNA selbst vernetzt wird, dann sollte der Transfer unterbrochen werden. Charakterisierung der im Capsid zurückgebliebenen RNA sollte aufklären ob ein bestimmtes Ende zuerst entlassen wird. Im Verlauf der Untersuchungen stellte sich heraus, dass HRV2 in Pufferlösung sein Genom nicht vollständig ausstößt, somit erübrigt sich Vernetzung. Die Konformationsänderungen, die den Genomtransfer bedingen laufen über eine Zwischenstufe- das 135S Partikel ab. Wird HRV2 in reiner Pufferlösung angesäuert, so läuft die Freisetzung des Genoms nur bis zu dieser Zwischenstufe ab. Das 135S Partikel hat allerdings einen Teil der RNA freigesetzt. Mithilfe von RNase A und RT-PCR konnte festgestellt werden, das das 3´Ende des Genoms RNase A zugänglich ist, während das 5´ Ende geschützt ist.

Abstract

(Englisch)

Human Rhinoviruses (HRVs) are depending on a human cell to generate progeny. The natural host cell of HRV is a ciliated epithelial cell in the respiratory tract; HRV infections are responsible for about 50% of mild infections of the upper respiratory tract. HRVs consist of an RNA genome protected by a protein shell (capsid). The aim of this study was to elucidate the mechanism of uncoating of Human Rhinovirus A2 (HRV2), i.e. the process of genome release from the capsid. Coarsely, HRV2 binds to its cognate receptor and is taken up by the cell via endocytosis. Endocytosed vesicles get acidified, and this drop of pH causes the HRV2 particle to change its morphology. Conformational changes of the viral proteins lead to expansion of the capsid, pores are opened and the RNA is released. The viral capsid is symmetric; therefore several pores are opened simultaneously. We wanted to know: Is the RNA genome ejected by one particular pore, or are several points of egress chosen, with loops protruding from the holey capsid? If one pore is chosen, does the RNA emerge as a single strand, or in a paired conformation? Is there a directionality of egress, i.e. is it regulated that a particular end of the RNA exits first? Those questions were addressed by two different chemical methods that were focused on either quickly capturing a snapshot of RNA in the act of egress or alternatively, halting exit of the genome. In Selective 2´-Hydroxyl Acylation and Primer Extension (SHAPE) an electrophile reagent reacts with the 2´hydroxyl (2´OH) group of RNA to form an ester; exclusively nucleotides that are not involved in base pairing or tertiary interactions are accessible to modification. Several chemicals were shown to be suitable for SHAPE chemistry; depending on the chemical, the reaction is complete in down to ~1 second. Due to this fast reactivity, a snapshot of RNA release can be taken, determining the length and nature of the protruding part of the genome. Modifications are detected by a halt in reverse transcription, the output of a SHAPE experiment are cDNA fragments of different length. The method was adjusted to allow for the analysis of cDNA fragments by an ABI PRISM®310Genetic Analyzer. However, this change of the protocol did not allow data analysis by the software designed for SHAPE analysis and an alternative program proofed to be unreliable. Therefore, another approach to assessing directionality of RNA release from HRV was chosen. Formaldehyde reacts with both amino acids as well as the bases of nucleic acids. Crosslinking of RNA to the capsid would halt RNA egress and allow characterization of the remaining part of the RNA. Halting egress turned out to be expendable, because the chosen conditions to stimulate RNA release were insufficient. Acidification of HRV2 in plain buffer solution primes the virus for uncoating but is not sufficient to trigger release of the RNA genome. Even following acidification of diluted samples for 30 minutes at 37°C, the majority of the particles did not release their genome, as demonstrated by resistance of the viral RNA to bovine pancreatic ribonuclease A (RNase A). Using SDS-PAGE and western blotting, the particles generated by acidification were identified to be uncoating intermediates (135S particles) that have lost the small viral protein VP4 but still contain RNA. In the 135S particle, part of the RNA is accessible to digestion by RNase A. Recovery of the RNA and PCR analysis following reverse transcription revealed that the 3´ end of the genome is missing whereas the 5´end is protected.

Autor*innen

Katharina Huszar

Haupttitel (Englisch)

Investigating directionality of genome release from human rhinovirus A 2

Paralleltitel (Deutsch)

Untersuchung der Direktionalität des Genomtransfers von Humanem Rhinovirus A 2

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

97 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Dieter Blaas

Klassifikation

42 Biologie > 42.32 Virologie

AC Nummer

AC11798831

Utheses ID

26855

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter