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Structural investigation of titin – α-actinin interactions in the Z-disk context
Viktor Deineko
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Kristina Djinovic-Carugo
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.30248
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30458.34792.681761-6
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Das Sarkomer wird häufig als kontraktile Einheit der gestreiften Muskelfasern beschrieben. Es ist in Längsrichtung der Muskelfaser hintereinander gereiht und wird an beiden Seiten durch die sog. Z-Scheiben begrenzt. Innerhalb des Sarkomers wird durch die Gleitbewegung der dünnen und dicken Filamente gegeneinander chemische Energie in Form von ATP, in eine mechanische Kontraktion umgewandelt. In den Sarkomeren gibt es drei Filamentsysteme: dünne F-Actin Filamente, dicke Myosin- sowie Titinfilamente. Actin und Myosin stellen den Kern der kontraktilen Maschinerie dar, während Titin die Rolle eines molekularen Maßbandes spielt. Entsprechend der Funktion des Sarkomers haben detaillierte Untersuchungen seine ausgesprochen hohe Komplexität gezeigt. Muskelzellen sind durch genaue zeitliche und räumliche Koordination, strikte Regulation der Einzelkomponenten sowie Flexibilität und Robustheit charakterisiert. Dieser hohe Ordnungsgrad wird weitgehend durch die Verankerung aller Sarkomerfilamente in den molekularen Strukturen der Z-Scheiben und M-Bändern möglich. So sind die dünnen Filamente von gegenüberliegenden Sarkomeren durch α-Actinin mit kleinen quadratische Muster in der Z-Scheibe quervernetzt. Die dicken Myosinfilamente hingegen sind mit den M-Bändern zu einem Gitter mit 6-facher Symmetrie verbunden. Bereits seit langem sind die M-Bänder Forschungsgegenstand vieler Wissenschaftler, wohingegen die Z-Scheiben bisher weitgehend unerforscht sind. Hier sind die Details über die Ausbildung und Funktionsweise der molekularen Strukturen der Z-Scheiben von besonderem Interesse. Die vorliegende Studie hat sich auf zwei Strukturproteine konzentriert, die zusammen mit F-Actin das Gitter der Z-Scheiben aufbauen. Als Ergebnis wurden folgende Ziele erreicht: 1 Mehrere Isoformen der sog. Titin Z-Repeats (kleine sich wiederholende Motive im N-terminalen Bereich von Titin) wurden aus cDNA Datenbanken menschlicher gestreifter Muskelzellen isoliert. Diese Isoformen enthalten eine unterschiedliche Anzahl an Titin Repeats: so findet man Titin mit vier und sechs Repeats in Skelettmuskeln hingegen sieben Repeats im Herzmuskelgewebe. 2 Auf Grundlage der Isoform mit sieben Repeats wurde eine Proteinkonstrukt Datenbank erzeugt. Diese Datenbank enthält sowohl separate Repeats als auch verschiedene interagierende und nicht-interagierende Motive, die die gesamte Region in Titin abdecken. 3 Ein Protokoll für die Rekonstitution von Titin- α-Actinin Komplexen wurde entwickelt. Dazu wurden zunächst beide Proteine in E. coli Stämmen mit erweiterter Codon Nutzung co-exprimiert. Nachfolgend wurde der Komplex über mehrere Reinigungsschritte isoliert. Hier kamen Affinitätschromatographie mittels immobilisierte Metallionen (IMAC) sowie Größenausschlusschromatographie (SEC) zum Einsatz. Ionenaustauchchromatographie wurde entweder als Zwischenschritt vor der SEC oder als finaler Politurschritt eingesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Entfernung von bakteriellen Proteinen als auch von Abbauprodukten des Zielproteins. 4 Die folgenden Einzeldomänen Komplexe wurden rekonstituiert EF-Hände 1-4 plus Zr.1 EF-Hände 1-4 plus Zr.7 EF-Hände 3-4 plus Zr.1 EF-Hände 3-4 plus Zr.7 EF-Hände 1-4 plus Zr.1-2-3 EF-Hände 1-4 plus Zr.5-6-7 5 Das Molekulargewicht der Einzeldomänen EF-Hände 1-4 und 3-4 sowie das der rekonstituierten Komplexe wurde durch SEC gekoppelte statische Lichtstreuung (SLS) ermittelt. Die Daten legen eine 1:1 Stöchiometrie der Komponenten innerhalb der Komplexe nahe. Ergebnisse die gut mit den Literaturwerten übereinstimmen. Die ausschließliche Wechselwirkung der EF-Hände 3-4 von α-Actinin mit Z-Repeats von Titin kann als gegeben angesehen werden. Die Bindungsstellen sind nur in Zr.1 oder 7 vorhanden. 6 Der Sekundärstrukturanteil der EF-Hände wurde mittels Cirkulardichroismus analysiert. Hier konnte gezeigt werden, dass diese Domänen hauptsächlich α-helicale Bereiche enthalten und sich dieser Anteil durch Wechsekwirkung mit den Z-Repeats noch deutlich erhöht. 7 Die Analyse des großen Titin- α-Actinin Komplexes bestätigte die 1:1 Stöchiometrie der Komponenten. 8 Eine Anzahl an rekonstituierten Komplexen sowie EF-Hände 1-4, EF-Hände 1-2 und EF-Hände 3-4 wurden mittels Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) charakterisiert. Hiermit wurden Parameter wie der Gyrationsradius, die maximale Partikelgröße, das Molekulargewicht und die Gesamtform der Komplexe bestimmt. Die SAXS-Daten stimmen gut mit den Ergebnissen der biophysikalischen Charakterisierung überein. Darüberhinaus konnten klare Unterschiede zwischen den EF-Hände 1-2 und den EF-Hände 3-4 festgestellt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die maximale Größe der Komplexe kleiner ist als der Abstand zwischen den Schichten von zwei Z-Scheiben. Zusammenfassend wurde eine Anzahl an Titin Z-Repeat Konstrukten erzeugt. Diese Konstrukte stellen zusammen mit einzelnen EF-Hand Domänen und verkürztem α-Actinin eine komplette Datenbank dar um die Wechselwirkung von Muskelproteinen zu untersuchen. Die Protokolle für die Rekonstitution und Reinigung der Titin-α-Actinin Komplexe wurden erfolgreich etabliert. Die mit diesem Protokoll erhaltenen Komplexe sind sowohl stabil als auch homogen und wurden für die weitere Charakterisierung mit modernsten biophysikalischen Methoden herangezogen. Die in dieser Studie erhobenen Daten stützen nicht die These, dass Titin Z-Repeats als Regulatoren der Z-Scheiben Dicke agieren und die Anzahl seiner Schichten bestimmen.
Abstract
(Englisch)
The sarcomere is often described as a contractile unit in the striated muscle fibers. This unit is repeated along the length of the fiber and limited by the Z-disks from both sides. Within the sarcomere the chemical energy of ATP is converted into mechanical contraction through the sliding motion of thin and thick filaments relatively to each other. Three main filament systems present in the sarcomere are thin F-actin filaments, thick myosin filaments and titin filaments. Actin and myosin represent the core of contractile machinery, whereas titin plays a role of a molecular ruler. The detailed studies of the sarcomere reveal a great level of complexity commensurate with the functions it performs. Precise coordination of all processes in space and time, strict regulation of individual components, as well as flexibility and robustness are all key features of muscle cells. The order is largely enabled by the anchoring of all sarcomeric filaments into the molecular grids of the Z-disk and the M-band. The thin filaments from adjacent sarcomeres are cross-linked by α-actinin into the small square lattice in the Z-band. The thick myosin filaments are interconnected at the M-band into a lattice with 6-fold symmetry. Since a long time, the M-band has been a research target of many scientists, whereas the Z-disk has remained largely unexplored until now. The details of forming and functioning of the Z-band macromolecular grid are of particular interest. The present study was focused on two structural proteins (titin and α-actinin), which build the Z-disk lattice in conjunction with the F-actin.   The following results were obtained in the present work: 1 Several isoforms of titin Z-repeats (Zrs) were isolated from human striated muscle cDNA libraries. These isoforms contain different arrays of titin repeats: four and six repeats are found in skeletal muscles, and seven repeats are found in cardiac muscle. 2 Using the seven repeat isoform as a basis, a protein constructs toolkit was created. This toolkit includes both separate repeats (peptides) and various combinations of interacting and non-interacting Z-repeats, completely covering the corresponding region of titin. 3 A protocol for the reconstitution of titin – α-actinin complexes was developed. It included both protein co-expression in the “rare-codon” optimized E.coli strain and several consequent purification steps. Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and size-exclusion chromatography (SEC) were employed for the purification of the complexes. Ion-exchange chromatography was utilized either as a polishing step or as an intermediate step preceding SEC. This approach allowed the removal of both contaminating bacterial proteins and degradation products. 4 The following “single-domain” complexes were reconstituted: EF-hands 1-4 plus Zr.1; EF-hands 1-4 plus Zr.7; EF-hands 3-4 plus Zr.1; EF-hands 3-4 plus Zr.7; EF-hands 1-4 plus Zr. 1-2-3; EF-hands 1-4 plus Zr. 5-6-7. 5 The molecular weights of single EF-hands domains 1-4 and 3-4 as well as of the reconstituted complexes were estimated by static light scattering coupled with analytical size-exclusion chromatography. The obtained data suggest a 1:1 stoichiometry of the components in the reconstructed complexes. These findings are in good agreement with the data available  in the literature (Atkinson et al., 2001; Joseph et al., 2001). We further confirmed by this that only EF-hands 3-4 of α-actinin are able to interact with titin Z-repeats. The binding sites are present only at Zr. 1 or 7. 6 The secondary structure content of EF-hands domains was analyzed by circular dichroism spectroscopy. It was shown that these domains contain mainly α-helical elements. It was also shown that the percentage of α-helices had significantly increased upon interaction with the Z-repeats. 7 The analysis of the large titin – α-actinin complexes further confirmed the 1:1 stoichiometry of the binding components. 8 A number of reconstituted complexes, as well as EF-hands domain 1-4, EF-hands domain 1-2 and EF-hands domain 3-4 were characterized by small-angle X-ray scattering (SAXS). Overall parameters (radius of gyration, maximum size of the particle, molecular mass) and low resolution shapes of the molecular assemblies were determined. The SAXS data were in good agreement with the results of the biophysical experiments. Moreover, clear difference between EF-hands domain 1-2 and EF-hands domain 3-4 was found. It was also shown that maximum size of the complexes is smaller than distance between the Z-disk layers. In summary, a number of titin Z-repeat constructs was created. These constructs, together with single EF-hands domains and truncated α-actinin 2, present a complete toolkit to study interactions of given muscle proteins. The protocols for the reconstitution and purification of titin–α-actinin complexes were successfully established. The complexes obtained by the developed protocols were stable and homogeneous. They were used for further characterization using available state-of the-art biophysical methods. The body of data, obtained as a result of the present research work, does not support the idea that sole titin Z-repeats can act as the regulators of the Z-disk thickness in determining the number of its layers. It is possible to suggest that the primary role of titin/α-actinin interactions is to robustly integrate titin within the Z-disk macromolecular grid. Taking into account the functions of titin in the sarcomere it is clear that this protein must be positioned with the high level of precision and tightly fixed at both amino- and carboxy-termini. The studied interaction of Z-repeats and α-actinin EF-hands is one of the mechanisms responsible for anchoring and correct positioning of titin N-terminus within F-actin – α-actinin scaffold.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
sarcomere Z-disk titin alpha-actinin EF-hands protein interactions
Schlagwörter
(Deutsch)
Sarkomer Z-disk titin alpha-actinin EF-hands Protein-Interaktionen
Autor*innen
Viktor Deineko
Haupttitel (Englisch)
Structural investigation of titin – α-actinin interactions in the Z-disk context
Paralleltitel (Englisch)
Structural investigation of titin – α-actinin interactions in the Z-disk context
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
XVII, 125 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Annalisa Pastore ,
John Trinick
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11788351
Utheses ID
26970
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |
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