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Development of a plasmid shuttle vector system for CRISPR studies in the archaeon Sulfolobus solfataricus

Isabelle Anna Zink

Art der Arbeit

Diplomarbeit

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Christa Schleper

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DOI

10.25365/thesis.30280

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29183.70094.940261-7

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Sulfolobus solfataricus, ein Vertreter der dritten Domäne des Lebens – den Archaeen, ist ein hyperthermophiler Mikroorganismus, der sich zu einem wichtigen Modellorganismus etabliert hat. Er gehört zu den Crenarchaeota, und war der erste seiner Art, der mit einem vollständigen Transformationssystem auf Basis des Sulfolobus-shibatae Virus 1 (SSV1) ausgestattet wurde. Vektoren, die auf der DNA des SSV1 Virus basieren, verbreiten sich nicht nur über Zellteilung, sondern können sich eigenständig über Zellinfektion verteilen. Diese Eigenschaft ist einerseits von Vorteil, da das Transformationssystem nicht an ein stringentes Selektionssystem gebunden ist. Andererseits bringt der infektiöse Charakter stark schwankenden Virus Zahlen und auch Veränderungen der frei-vorliegenden Form des Virus mit sich, was zur Beeinträchtigung wichtiger genetischer Studien, wie beispielsweise Gen - Überexpression oder - Ausschaltung (Gen-Knockout), führt. Frühere Versuche, ein nicht-infektiöses Transformationssystem für S. solfataricus zu entwerfen, stellten sich als schwierig heraus. Das Ziel dieser Studie war es, einen Transformationsvektor basierend auf einem Plasmid zu konstruieren, welcher in niedriger Kopienzahl in Uracil – auxotrophen S. solfataricus P1 Mutanten stabil erhalten bleibt. In den bereits bestehende Vektor pCmalLacS, der auf der Nukleinsäuresequenz des pRN1 Plasmids aus S. islandicus basiert, wurde eine Gateway® Rekombinationskassette mit einem davorstehenden Arabinose induzierbaren Promoter innerhalb mehrerer Klonierungsschritte eingebracht. Durch diese Kassette konnten in den resultierten Zielvektor pCAra-GW gewünschte Sequenzen über die etablierte Gateway®-Klonierung eingebracht werden, wodurch verschiedene pIZ-Expressionsvektoren konstruiert wurden. Die Transkription der eingebrachten Sequenzen ist durch Zugabe von Arabinose in das Nährmedium durch den Promoter induzierbar. Fünf verschiedene pIZ-Expressionsvektoren, jeweils eine andere integrierte Sequenz enthaltend, wurden im Laufe dieser Studie erstellt und erfolgreich innerhalb drei verschiedener Transformationsansätzen durch Elektroporation auf die S. solfataricus Zellen übertragen. Die Zellen wurden anschließend in selektivem N-Z-Amine/Saccharose Medium inkubiert. Im Gegensatz zu früheren Studien, war es uns möglich, genomische DNA der Sulfolobus Transformanten in E.coli zu retransformieren und das intakte pIZ-Plasmid aus E.coli wieder zu extrahieren. Über Southern Hybridisierung konnten wir nicht nur die Präsenz der Plasmide nachweisen, sondern auch, dass sie nicht – integriert, in freier Form im Zytoplasma vorlagen. Die Kopienzahl des Vektors pro µg DNA wurde durch die quantitative PCR Methode bestimmt, indem ein chromosomales Gen als Referenz herangezogen wurde. Die Anzahl der Chromosomen und des transformierten pIZ-WOP Expressionsvektors pro µg DNA waren annähernd ident (um die 3x106 Kopien pro µg DNA), was bedeutet, dass die Kopienzahl des Plasmids eins – bis zwei pro Zelle betrug. Des Weiteren wurden die Plasmide praktisch angewandt um die Aktivität des CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Systems zu untersuchen. CRISPR ist ein kürzlich entdecktes Immunsystem-Äquivalent vieler Prokaryoten, welches wirkend durch spezifische RNA Fragmente, extrazellulären Eindringlingen durch Nukleinsäuresequenz - Erkennung abwehrt. Ein CRISPR Lokus liegt im Chromosom und besteht aus einer Ansammlung kurzer, unterschiedlicher Spacer-Sequenzen, welche von meist uniformen, Palindromseuqenzen, sogenannten “repeats“ voneinander abgegrenzt werden. Spacer sind DNA Sequenzen, die von Viren oder Plasmiden aus einer früheren Infektion der Zelle oder der Vorgängerzellen stammen. Transkription dieser Loki bringt kurze crRNAs (CRISPR RNA) hervor, welche aus einem Spacer und Teilen der angrenzenden „repeats“ bestehen, in Proteinkomplexe eingebaut werden und komplementäre fremd-DNA oder – RNA (sogenannte „protospacer“) binden und durch Enzymaktivität abbauen. In unserem Labor wurden vor kurzem solche Protospacer, welche dem Spacer 63 des Lokus D im S. solfataricus Genoms entsprechen, so verändert, dass CRISPR- vermittelter DNA Abbau (DNA-Interferenz) durch Fehlpaarung in der Nukleinsäuresequenz (GU pairing - Konstrukt D63-7U), und noch effektiver, durch Basen-Komplementarität des Protospacers zum Autoimmunität - 5‘ Endes (handle) der crRNA (Konsrukt D63-HA), verhindert wurde. Transformationsstudien von S. solfataricus M18 mit SSV1 Virus Vektoren, welche diese Protospacer integriert trugen, führten zu stabilen Viren in den Zellen, aber zum Abbau der Protospacer mRNA. Gegenteilig, deuten unsere Ergebnisse auf eine DNA-Inteferenz welche zum Verlust der Plasmiden in den Kulturen führte (wenn auch in unterschiedlichem Maße), wenn dieselben Protospacer in pIZ-Plasmiden transformiert worden waren. Nur geringe Kopienzahlen für pIZ-HA Plasmid (3.1x105 copies/µg DNA) und weniger als 400 Kopien des pIZ-7U Vektors konnten nachgewiesen werden, während negativ Kontrollen, die keinen Protospacer enthielten, mit Kopienzahlen von 3.18x106 per µg DNA stabil waren. Überraschenderweise, wurde für alle Kulturen ähnliches Wachstum und ähnliche Chromosomen Anzahl (durch qPCR) gemessen, was darauf hindeutete, dass einige Zellen, die mit dem Protospacer Plasmiden transformiert worden waren, ihr defektes pyrEF Operon, höchstwahrscheinlich über Homologe Rekombination als Reaktion auf den CRISPR DNA-Angriff, wiederhergestellt hatten. Alles in allem, zeigen unsere Resultate, dass das CRISPR System verschieden auf die Art des extrachromosomalen Elements, welches einen Protospacer trägt, reagieren.

Abstract

(Englisch)

The hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus has become an important model organism in different fields not least because of its amenability for genetic manipulation. The acidophilic Crenarchaeote was the first hyperthermophilic archaeon equipped with a functional and widely applicable genetic system on the basis of the lysogenic fusellovirus Sulfolobus-shibatae virus 1 (SSV1). SSV1 based vectors spread throughout the culture which is advantageous in that successful transformation does not rely on stringent selection. However, the infectious nature of the virus system interferes with overexpression and knockout studies due to highly variable copy numbers of free virus particles and also to variation of the SSV1 genome in its episomal form. Previous attempts to establish a non-spreading transformation system which would overcome this unfavorable effect of the virus, however, turned out to be difficult. The goal of this study was to design and establish a plasmid based shuttle vector that is stably maintained in low copy numbers in uracil auxotroph S. solfataricus P1 mutants and to explore its use for studying the virus defense system in Sulfolobus. The Sulfolobus-E.coli shuttle vector pCmalLacS which is based on the S. islandicus pRN1 plasmid was modified by introducing a Gateway® cassette with an arabinose inducible promoter upstream of it. The resulting Gateway® destination vector pCAra-GW was used for site-specific recombination of different inserts producing the so called, pIZ expression vectors able to overexpress the transcripts of the inserted sequences upon arabinose induction. Five different variants of pIZ vectors were successfully transformed within three transformation approaches following standard SSV1 electroporation protocols and growth of transformants in N-Z-amine/sucrose selective media. We were able to retransform total DNA of transformants into E.coli and recovered the intact plasmid from all analyzed colonies. Additionally, Southern hybridization verified the presence of the pIZ vectors in the culture and elucidated the plasmids to reside as episomes in the cytoplasm. Plasmid copies were determined by qPCR using a chromosomal gene as reference. Numbers of chromosomes and plasmid counts were almost equal (around 3x106 per µg total DNA) in pIZ-WOP transformants implying a plasmid copy number of between one and two per cell. Furthermore, the plasmids were used to investigate in vivo the activity of the CRISPR system (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), a recently identified RNA - based defense barrier protecting host cells from extracellular invaders. Six CRISPR loci located in the S. solfataricus genome each containing reservoirs of short sequence fragments, called spacers which stem from viruses or plasmids of former infections and are separated by repeats. Upon transcription of those loci small crRNAs (CRISPR RNA) comprising a spacer and parts of the adjacent repeats are incorporated into protein complexes which can cleave either DNA or RNA sequences of invaders (protospacers) when matching the crRNA. Recently, protospacer constructs matching the spacer 63 of S. solfataricus CRISPR locus D were modified in our laboratory in that they circumvented CRISPR - mediated DNA interference by mismatches allowing GU pairing (D63-7U) and even more efficiently, by complementarity to the autoimmunity 5’ handle of the crRNA (D63-HA). Transfection studies of S. solfataricus M18 with SSV1-based virus vectors harboring these protospacers therefore led to preservation of the vector within the cell but to degradation of the mRNA of the protospacers. Astonishingly, we did not see these effects when transforming S. solfataricus M18 with pIZ plasmids harboring the same protospacers. Contrarily, our results indicate DNA interference (although to different degrees) of the protospacers which led to the loss of the plasmid in the culture. Only low numbers of the pIZ-HA construct (maximum 3.1x105 copies/µg DNA) and less than 400 copies for pIZ-7U were detected in total DNA preparations of transformed cells, whereas negative controls without a matching protospacer were stably maintained in the culture with copies of up to 3.18x106 per µg DNA. Surprisingly, growth of transformants and equal chromosomal copies (measured by qPCR) were obtained in all samples, indicating that at least some cells transformed with matching protospacers have restored their defective pyrEF most likely through homologous recombination possibly as a rescue effect upon CRISPR DNA interference. Altogether, our results indicate a different reaction of the CRISPR system upon transformation with virus- and plasmid shuttle vectors harboring the same protospacer.

Autor*innen

Isabelle Anna Zink

Haupttitel (Englisch)

Development of a plasmid shuttle vector system for CRISPR studies in the archaeon Sulfolobus solfataricus

Paralleltitel (Deutsch)

Entwicklung eines Plasmid - Shuttle - Vektors für CRISPR Studien in dem Archaeon Sulfolobus solfataricus

Publikationsjahr

2013

Umfangsangabe

133 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*in

Christa Schleper

Klassifikationen

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines ,

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften

AC Nummer

AC11809742

Utheses ID

27000

Studienkennzahl

UA | 441 | | |

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Schlagwörter