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Glycan Interactions in Amoebae
Stefan Mereiter
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Graham Warren
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.30356
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30035.68766.587666-5
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Dictyostelium discoideum ist eine seit vielen Jahren erforschte Amöbe, welche, ausgelöst durch Hungerstress, in der Lage ist in einen Lebenszyklus zu wechseln, in welchem es mit tausenden anderen Zellen aggregiert und einen echten vielzelligen Organismus bildet. In dieser vielzelligen Entwicklungsphase differenzieren und spezialisieren sich einzelne Zellverbände unterschiedlich, was zu intra- und extrazellulären Veränderungen führt. Zum Beispiel verändert sich das N-Glykom. Während in der einzelligen Amöbe die neutralen N-Glykane vor allem α-1,3-Kern-fucosyliert sind und bis zu acht Mannosen und sogenannte „intersecting“ und „bisecting“ N-Acetylglucosamine tragen, tragen die neutralen N-Glykane der differenzierten Zellen keine „intersecting“ und „bisecting“ N-Acetylglucosamine und nur noch bis zu fünf Mannosen. Lediglich die α-1,3-Kern-fucosylierung bleibt unverändert. Die Funktion dieser α-1,3-Kern-fucosylierung ist nachwievor unklar, jedoch scheint es sicher, dass in Dictyostelium discoideum zumindest ein Lektin existiert, welches an dieser funktionellen Gruppe binden kann. In meiner Arbeit bekräftige ich diese Annahme mittels Westernblot-Experimenten. Des Weiteren habe ich durch Affinitätschromatographie im D. discoideum Lysat nach Lektinen gesucht die in der Lage sind an HRP, einem Pflanzenprotein das α-1,3-Kern-fucosylierte N-Glykane trägt, zu binden. Die so isolierten Proteine wurden anschließend massenspektrometrisch analysiert. Hierdurch konnte ich tatsächlich ein potentiell α-1,3-Kern-fucosylierungs-bindendes Lektin identifizieren mit dem Namen Discoidin I. Um weitere biochemische Analysen mit dem Protein durchzuführen wurde eines der drei Discoidin I Gene, das dscA-1 Gen, mit einem N-terminalen His-tag in dem E. coli Expressionsstamm BL21 exprimiert und mittels Ni-NTA-Säule aufgereinigt. Abschließend wurden einige einfache Versuche über das Bindungsverhalten des Proteins durchgeführt die zu unerwarteten Ergebnissen führten. Da Discoidin I einen relativ komplexen Aufbau hat, bestehend aus zwei Zuckerbindungsstellen, eine N- und eine C-Terminal, wurden zusätzlich die Termini separat kloniert. In dieser Arbeit erbringe ich Beweise für einen neuen, natürlich vorkommenden Bindungspartner von Discoidin I, und stelle der wissenschaftlichen Nachwelt rekombinante Discoidin I Expressionsstämme zur Verfügung mit deren Hilfe große Fortschritte in der entwicklungsbiologischen Aufklärung von Dictyostelium discoideum gemacht werden könnten.
Abstract
(Englisch)
Dictyostelium discoideum is a well-studied social amoeba that upon starvation undergoes a developmental shift in which it aggregates with thousands of other cells to form a real multicellular organism in which subsets of cells differentiate and specialize to perform certain tasks. During this developmental shift many of D. discoideum’s intra and extracellular properties change as for instance its N-glycome. The majority of N-glycans of single cellular D. discoideum carry an α-1,3-core-fucosylation, up to eight mannoses and intersecting and bisecting N-acetylglucosamines. These glycan structures change dramatically during cell differentiation leading to non-intersected and non-bisected N-glycans with in total only five mannoses, but the α-1,3-core-fucose remains. To date the biological function of the core-fucose and N-glycomic shift is a puzzle. It seems more than certain that at least one specific N-glycan-binding lectin exists in this organism. Here I show inhibition western blots that support this assumption. Hence I performed an affinity chromatographical screening for lectins by offering HRP, a plant protein carrying quite simple α-1,3-core-fucosylated N-glycans, to D. discoideum lysates. Subsequent MALDI-TOF mass spectrometry protein mass fingerprint analysis and MS/MS peptide sequencing identified isolated proteins. By this method the lectin discoidin I could be identified as a potential D. discoideum-N-glycan-binding protein. This protein is a well-known lectin of D. discoideum whose function is still unknown but whose expression starts after aggregation of the amoeba and therefore might play a role coordinated with the smaller N-glycan structures. Due to further investigations on the biochemical properties of Discoidin I, dscA-1, one of three Discoidin I chains occurring in the organism, has been expressed with an N-terminal His-tag in BL21 E. coli expression strains and purified on Ni-NTA columns. The so purified Discoidin I was then subject to simple examinations of its binding properties which led to unexpected results that might be due to the expression system chosen or the experimental set up. Additionally due to the complicated structure of discoidin I, actually consisting of 2 sugar-binding sites one at each terminus, two truncated discoidin I proteins comprising either only one of the binding sites were expressed. In this thesis I present evidence for a novel natural binding partner of discoidin I and provide expressed proteins which might render future scientific breakthrough on developmental research of D. discoideum possible.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Englisch)
lectin glycan Dictyostelium discoideum discoidin I
Schlagwörter
(Deutsch)
Lektin Glykan Dictyostelium discoideum discoidin I
Autor*innen
Stefan Mereiter
Haupttitel (Englisch)
Glycan Interactions in Amoebae
Paralleltitel (Deutsch)
Glykaninteraktionen in Amoebae
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
75 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Graham Warren
Klassifikationen
35 Chemie > 35.71 Biochemische Methoden ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11812703
Utheses ID
27062
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
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