Detailansicht
Analysis of growth cone collapse and axon retraction in primary mouse neurons by time-lapse and fluorescence microscopy.
Thomas Georg Voelk
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Friedrich Propst
DOI
10.25365/thesis.30445
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30114.42804.304553-2
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Stickstoffmonoxid (NO)-Signaltransduktion wird mit zahlreichen physiologischen Prozessen in Verbindung gebracht, darunter Wachstum und Reifung von Neuronen. NO wird von der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS) nach deren Aktivierung durch Ca2+ synthetisiert und kann direkt durch S-Nitrosylierung von Proteinen wirken. Es wurde gezeigt, dass das die Axon-Retraktion beeinflusst, aber ein anderer NO-abhängiger Mechanismus darin auch eine Rolle spielt. Die Signalkaskade, welche NO, lösliche Guanylylcyclase (sGC) und cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) beinhaltet, war bereits Thema umfangreicher Forschung im Labor. Bisher erhaltene Ergebnisse, die auf der Analyse fixierter Zellen beruhten, untermauerten eine vorgeschlagene regulative Rückkoppelungs-Hemmung von cGMP-abhängiger Proteinkinase (PKG) auf nNOS. Ich wollte diese Ergebnisse mit Daten aus der Beobachtung von lebenden Zellen ergänzen. Daher musste die früher etablierte Analysemethode für Zeitraffer-Mikroskopie adaptiert werden. Unter Verwendung von adulten Neuronen aus Mäusespinalganglien analysierte ich die Rate der Axon-Retraktion die, nach der Behandlung mit verschiedenen inhibierenden Substanzen, durch die klassischen Kennzeichen (knollenförmiges Axon, sinusoidaler Axon-Schaft und Zurückbleiben einer Spur) indiziert war.
Ich bestätigte in Zeitraffer- und Immunfluoreszenzmikroskopie, dass wildtyp-DRG Neuronen sich nach der Behandlung mit Roscovitin zurückzogen. Die Calcium-Ionophore Calcimycin wurde zur Erhöhung der intrazellulären Konzentration von Ca2+ verwendet, aber im Gegensatz zu früheren Laborkollegen war es mir nicht möglich die Konzentration von 10 μm in der Zeitraffermikroskopie anzuwenden, da das den Großteil der Zellen tötete. Niedrigere Konzentrationen hatten im Vergleich zur Kontrolle mit Lösungsmittel keinen signifikanten Effekt. Um den Einfluss der sGC auf die Axon-Retraktion zu untersuchen verwendete ich die Inhibitoren LY83583 und ODQ in meinen Experimenten, konnte aber in keinem Fall signifikante Effekte beobachten. Auch unter Anwendung des Protokolls für fixierte Zellen hatte die Behandlung mit LY83583 keinen Effekt, weder in An- noch Abwesenheit von Calcimycin. NPA wurde zur direkten Inhibition von nNOS verwendet. Ich konnte keine signifikanten Auswirkungen auf die Axon-Retraktion, die mit NPA in Verbindung gebracht werden konnte, feststellen. Zusammengefasst haben meine Daten die mutmaßlich hemmende Rückkoppelungsschleife von PKG zu nNOS nicht bekräftigt.
Der zweite Teil dieser Diplomarbeit behandelte einen möglichen Einfluss von Semaphorin3A auf das Verhalten von Wachstumskegeln von neonatalen kortikalen Neuronen. Semaphorin3A ist ein abstoßendes Wachstumssignal für Axone, kann aber auch anziehende Wirkung auf Neuriten aufweisen. Eine MAP1B-abhängige Reduktion im Wachstum von Neuriten aus hippokampalen und DRG-Gewebeexplantaten wurde im Labor bereits beobachtet, welche im Fall von Kultur dissoziierter Zellen aber ausblieb. Ich wiederholte die Behandlung an kortikalen Neuronen und verglich das Aussehen der Wachstumskegel mit unbehandelten Zellen. Die gesammelten Ergebnisse der Behandlung mit 100 ng/ml Semaphorin3A zeigten keinen beobachtbaren Effekt. Die Anhebung auf 500 ng/ml Semaphorin3A erhöhte den Kollaps der Wachstumskegel in einigen Fällen. Zusammengefasst sind meine Ergebnisse noch nicht eindeutig, aber weisen darauf hin, dass höhere Konzentrationen von Semaphorin3A nötig sein könnten, um Effekte in dissoziiert kultivierten Neuronen hervorzurufen.
Abstract
(Englisch)
Nitric oxide (NO)-signaling is implicated in various physiological processes including neuronal growth and maturation. NO is synthesized by neuronal nitric oxide synthase (nNOS) after activation by Ca2+ and can act directly through S-nitrosylation of proteins. It was demonstrated that this impacts axon retraction but a different NO-dependent mechanism also plays a role. The signaling cascade involving NO, soluble guanylyl cyclase (sGC) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) has been the topic of extensive research in the lab. Previous results obtained by analysis of fixed cells substantiated a proposed feedback inhibitory regulation from cGMP-dependent protein kinase (PKG) towards nNOS. I wanted to further support these results with live-imaging data. Therefore, the previously established method of analysis had to be adapted for time-lapse microscopy. Using adult mouse dorsal root ganglion neurons I examined the rate of axon retraction as indicated by the classical hallmarks (retraction bulb, sinusoidal bundling of the axon shaft and trailing remnant) after treatment with different inhibitory substances for key enzymes in the pathway.
I confirmed that wild-type DRG neurons retracted after treatment with Roscovitine using both time-lapse and fluorescence microscopy. Calcium ionophore Calcimycin was used to increase intracellular levels of Ca2+ but unlike previous lab members, I was unable to apply Calcimycin in time-lapse microscopy at a concentration of 10 μm due to widespread cell death. Lower concentrations did not show a significant effect compared to vehicle control. To investigate the influence of sGC activity on axon retraction I used the inhibitors LY83583 and ODQ in my experiments but no significant changes in axon retraction could be observed after treatment in either case. Also when using the fixed-cell protocol, treatment with LY83583 had no effect, neither in the presence nor absence of Calcimycin. NPA was used to directly inhibit nNOS. I could not see any significant effects on axon retraction that was attributable to NPA treatment in live-imaging and PFA-fixed cells. Taken together, my data did not support the putative inhibitory feedback loop from PKG to nNOS.
The second part of this thesis dealt with a possible influence of Semaphorin3A treatment on growth cone behavior in neonatal mouse cortical neurons. Semaphorin3A is a repellent guidance cue for axons but can exert attractive properties on neurites as well. A MAP1B-dependent reduction in neurite outgrowth was observed previously in the lab in hippocampal and DRG explants but no effect was observed in dissociated cells of either origin after treatment. I repeated the treatments of cortical neurons and assessed growth cone appearance in comparison to untreated cells. The combined results of treatments with 100 ng/ml Semaphorin3A lack any observable effect. Increasing the concentration to 500 ng/ml Semaphorin3A significantly elevated growth cone collapse at several time points. Taken together my results are not yet conclusive but suggest that higher concentrations of Semaphorin3A may be needed to induce effects in these dissociated cultures.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
cytoskeleton axon guidance axon retraction growth cone collapse Cdk5 nNOS NO sGC cGMP
Schlagwörter
(Deutsch)
Zytoskelett Axon-Führung Axon-Retraktion Wachstumskegel-Kollaps Cdk5 nNOS NO sGC cGMP
Autor*innen
Thomas Georg Voelk
Haupttitel (Englisch)
Analysis of growth cone collapse and axon retraction in primary mouse neurons by time-lapse and fluorescence microscopy.
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse von Wachstumskegel-Kollaps und Axon-Retraktion in primären Mausneuronen mittels Zeitraffer- und Fluoreszensmikroskopie.
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
83 S. : graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Friedrich Propst
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC11818813
Utheses ID
27135
Studienkennzahl
UA | 490 | | |