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Morphology and fitness of the thiotrophic symbiont Cand. Thiobios zoothamnicoli in situ and in vivo
Judith Drexel
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Monika Bright
DOI
10.25365/thesis.30478
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29777.70955.775761-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Jahre 1981 wurde Riftia pachyptila entdeckt. Ein Vertreter der Pogonophora ohne Magen-Darm-Trakt, der einen chemolithoautotrophen Endosymbionten beherbergt (Cavanaugh, 1981; Feldbeck, 1981; Rau, 1981). Zuvor wusste man nur von phototrophen und heterotrophen Symbionten (see Dubilier et al. 2008). Diese Entdeckung führte zur intensiven Suche nach anderen chemolithotrophen Symbiosen, welche folglich bei vielen verschiedenen Arten und in unterschiedlichsten Lebensräumen gefunden wurden (see Cavanaugh et al. 2006). Chemolithotrophe Bakterien kommen in vielen Abstammungslinien vor, wobei Sulfid-oxidierende Bakterien hauptsächlich zu den Gammaproteobacteria gehören (see Dubilier et al. 2008).
Das Wissen über kooperative Interaktionen zwischen Wirt und Symbiont sowie die Evolution von chemolithoautotrophen Symbiosen ist gering und die Symbiose zwischen dem Ciliaten Zoothamnium niveum und seinem Sulfid-oxidierenden Ektosymbionten Cand. Thiobios zoothamnicoli stellt ein gutes, leicht zu manipulierendes System dar, um Einblicke über Evolution und kooperatives Verhalten von Wirt und Symbiont in einer chemolithoautortrophe Symbiose zu gewinnen. Nicht nur, dass Zoothamnium niveum eine schnelle Reproduktion und kurze Lebensdauer hat, es ist auch die einzige thiotrophe Symbiose, die man über mehrere Generationen kultivieren kann (Rinke et al. 2007).
Es ist bekannt, dass sich der Wirt Z. niveum zumindest teilweise von seinem Ektosymbionten ernährt. Zum einen wird von Cand. Thiobios zoothamnicoli unmittelbar nach Fixierung ausgeschiedener Kohlenstoff aufgenommen. Zum anderen wird der Ektosymbiont direkt gefressen (Rinke, 2002). Mittlerweile hat sich eine Studie mit der Anpassung – in Bezug auf Veränderung von Morphologie und Fitness - von Cand. Thiobios zoothamnicoli an optimale Kultivierungsbedingungen im Vergleich mit in situ Proben beschäftigt (Rinke et al. 2007), und Unterschiede wurden entdeckt.
In unserer Studie wurde dieser Ansatz wiederholt und weitergeführt. Wir untersuchten selbst in situ Proben und solche, die in vivo unter optimalen Bedingungen gezüchtet wurden und verglichen sie miteinander, wie auch mit der korrespondierenden Literatur (Rinke et al. 2007). Zudem stellten wir uns die Frage, was mit der Z. niveum Symbiose passiert, wenn sie in vivo unter ungünstigen Bedingungen – einerseits für Cand. Thiobios zoothamnicoli, andererseits für den Wirt – gehalten wird. Was passiert mit Cand. Thiobios zoothamnicoli, wenn sein Wirt in seiner normalen Ernährung eingeschränkt wird und keinen Zugang zu freilebenden Mikroben in der Wassersäule hat? Und was passiert, wenn dieses Bakterium unter Ausschluss von Sulfid gehalten wird? Welchen Einfluss hat dabei der Entwicklungszustand des Wirtes? Entwickeln sich Cand. Thiobios zoothamnicoli Populationen, die auf einer jungen, erst ans Substrat angedockten Verbreitungseinheit des Wirtes sitzen anders als solche, die mit erwachsenen Kolonien leben? Welchen Unterschied gibt es, wenn Sulfid bei stehender oder fließender Wassersäule ausgeschlossen wird? Um Einblick auf diese Fragen zu bekommen wurden Z. niveum Proben entweder ohne Sulfid oder unter axenischen Bedingungen gehalten.
Alle Proben, die für diese Arbeit untersucht wurden, stammen von unter Wasser liegendem Holz im Sv. Jernej Kanal neben der Saline Sečovlje in Piran, Slovenien. In situ Proben wurden unmittelbar für das Rasterelektronenmikroskop fixiert. Andere Proben wurden entweder als ausgewachsene Kolonien für 48 Stunden oder als Schwärmer für sieben Tage unterschiedlichen Bedingungen in vivo ausgesetzt. Die ausgewachsenen Wirts-Kolonien mit Cand. Thiobios zoothamnicoli wurden für 48 Stunden zum einen in einem `Flow-through respirometer`- Aquarium mit ~ 50 ml/h Fließgeschwindigkeit von 32 µm gefiltertem Wasser (FLOW) und zum anderen in mehreren Embryo Dish mit 0.2 µm gefiltertem Wasser gehalten (NO FLOW). Zum anderen wurden für drei verschiedene Experimente Schwärmer von Z. niveum in `Flow-through respirometer`- Aquarien inokuliert, welche darin in sieben Tagen zu Kolonien heranwuchsen. Folgende Zuchtbedingungen wurden hergestellt: Bei einer Fließgeschwindigkeit von ~ 50 ml/h wurde entweder 32 µm gefiltertes Wasser und Sulfid bereitgestellt (OPNA). Mit diesem Experiment wurden die optimalen in vivo Proben gezüchtet. Weiters wurde 0.2 µm gefiltertes Wasser und Sulfid bereitgestellt (OPA). Z. niveum wuchs dabei unter axenischen Bedingungen auf. Und weiters wurde 32 µm gefiltertes Wasser und kein Sulfid bereitgestellt (NONA), womit Cand. Thiobios zoothamnicoli der Zugang zu Sulfid verwehrt wurde.
Die erhaltenen Proben wurden ebenfalls für das Rasterelektronenmikroskop fixiert und mitsamt den in situ Proben für das Rasterelektronenmikroskop präpariert. Pro Versuchsansatz wurden von drei Z. niveum Kolonien jeweils 15 Fresszellen gescannt, welche folglich für die Erhebung von Parametern in Bezug auf Morphologie und Fitness in einen oberen (oralen) und einen unteren (aboralen) Teil geteilt wurden. Folgende Parameter wurden erhoben: Die Anzahl von Ektosymbionten sowie deren Deckungsgrad an Wirtsoberfläche wurden innerhalb eines 70 µm² Rahmens – welcher am Ende des oralen und aboralen Teils positioniert wurde – erhoben. Es wurde die Länge und Breite von bis zu 70 Ektosymbionten pro aboralem und oralem Teil der Fresszelle erhoben, wobei spiralförmig im Uhrzeigersinn zufällig gewählte Zellen vermessen wurden. Aus Länge und Breite wurde das Volumen (nach van Veen & Paul, 1979), wie auch der Cell elongation index (CI) berechnet. In gleicher Weise wie Länge und Breite wurde auch die ´frequency of dividing cells` (FDC) – der Prozentsatz an Zellen, die sich in Teilung befinden – erhoben, ein Maß für die Fitness der Ektosymbionten (Hagström et al. 1979). Diese Daten wurden in Zusammenhang mit der Anzahl an Zellen pro 70 µm² gebracht, um die absolute Anzahl an teilenden Zellen pro 100 µm² zu berechnen.
Beim Vergleich unserer in situ und OPNA Proben miteinander und mit der korrespondierenden Literatur (Rinke et al. 2007), zeigten die Cand. Thiobios zoothamnicoli Populationen gleiche Trends von Morphologie und Teilungsrate zwischen oralem und aboralem Teil der Microzooide. So waren Länge, Breite und folglich Volumen der Cand. Thiobios zoothamnicoli Zellen am oralen Teil der Microzooide stets signifikant höher als am aboralen Teil, während CI und FDC stets den gegensätzlichen Trend zeigten. Unterschiede zwischen den einzelnen Probensets bestanden in den aktuellen Mittelwerten der erhobenen Parameter. Die gleichen beobachteten Trends unterstützen die Annahme, dass Cand. Thiobios zoothamnicoli Zellen am oralen Teil der Microzooide durch das Schlagen der Cilien des Wirtes anderen chemischen Bedingungen ausgesetzt sind als solche Zellen, die den Rest der Wirtsoberfläche besetzen (Rinke et al. 2007). Die Unterschiede von genauer Größe und Teilungsrate zwischen den einzelnen Ansätzen wurden als Reaktion auf die gesamten chemischen Bedingungen interpretiert. Diese Ergebnisse bestärken die Bezeichnung von Cand. Thiobios zoothamnicoli als pleomorphen Zelltypen (Bauer-Nebelsick et al. 1996a,b; Rinke et al. 2006). Mikrozooide von Z. niveum Proben, welche unter FLOW Bedingungen gehalten wurden, waren teilweise von Filamenten mit Ausbuchtungen besetzt. Es wird angenommen, dass es sich bei diesen Filamenten um Cand. Thiobios zoothamnicoli handelt. Natürlich muss diese Annahme auf Basis einer Genanalyse überprüft werden. Wie auch immer, wenn es sich um Cand. Thiobios zoothamnicoli handelt, würde diese Entdeckung zu einer Erweiterung der bekannten Zellformen führen, welche Cand. Thiobios zoothamnicoli einnehmen kann. Die Funktion dieser Ausbuchtungen ist unbekannt und es stellt sich die Frage, ob es sich dabei um mögliche Dispersionseinheiten handelt, welche Cand. Thiobios zoothamnicoli unter unwirtlichen Bedingungen bildet. Es wäre also wichtig zu wissen, ob sich DNA in diesen Ausbuchtungen befindet und das Einfärben von Proben mit DAPI oder SYBR green wäre eine Überprüfungsmöglichkeit.
Es ist bekannt, dass Z. niveum sich zum Teil von Cand. Thiobios zoothamnicoli ernährt: zum einen von Kohlenhydrate, welche von Cand. Thiobios zoothamnicoli kurz nach der Fixierung ausgeschieden werden, zum anderen wird Cand. Thiobios zoothamnicoli direkt gefressen (Rinke, 2002). Um einen Einblick zu bekommen, was mit der Symbiose passiert, wenn Z. niveum keinen Zugriff zu seiner anderen Nahrungsquelle – den frei-lebenden Mikroben in der Wassersäule – hat, wurden die Experimente OPNA und OPA verglichen. Z. niveum zeigte eine um etwa 50% geringere Teilungsrate unter axenischen Bedingungen. Cand. Thiobios zoothamnicoli zeigte hingegen bei beiden Experimenten eine gleiche Anordnung auf der Wirtsoberfläche wie eine gleiche Teilungsrate und trotzdem wurden die kleineren Wirts-Kolonien des axenischen Experiments nicht überwuchert. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass tote Z. niveum Kolonien von ihren Symbionten überwuchert werden können (pers. obs.). Demnach wird angenommen, dass ein Kontrollmechanismus wirken muss, welcher das Gleichgewicht zwischen Größe des Wirtes und Größe der Ektosymbiontenpopulation aufrecht erhält. Es wird angenommen dass dieser Kontrollmechanismus vom Wirt stammt, wie es auch bei anderen Experimenten in der Literatur der Fall ist (see Douglas, 2010; Brooks & Richards, 1955; Ruby and Asato, 1993; Whitehead & Douglas, 1993).
Neben der Untersuchung, was mit der Symbiose passiert, wenn der Wirt ungünstige Bedingungen vorfindet, wurde auch ein Augenmerk auf mögliche Veränderungen der Symbiose durch ungünstige Bedingungen für den Ektosymbionten untersucht. Dafür wurden die Proben des FLOW und NO FLOW Experiments untersucht. Diese Proben bestanden aus ausgewachsenen Kolonien, welche vor dem Beginn des Experimentes von einer etablierten Ektosymbiontenpopulation bedeckt waren. Auch nach den 48 Stunden Experimentierzeit waren die Wirts-Kolonien noch mit Ektosymbionten bedeckt. Ein Experiment mit gleichen Zuchtbedingungen, aber längerer Laufzeit, zeigte, dass Ektosymbionten noch auf der Wirtskolonie sitzen, wenn diese gestorben ist (pers. obs. Bright, M., 2013). Die Ektosymbionten waren zwar stark in ihrer Anzahl dezimiert, die verbleibenden Zellen zeigten jedoch eine signifikante Volumenzunahme, wie auch immer noch Teilungsaktivität. Keine nennenswerten Unterschiede waren dabei zwischen dem FLOW und dem NO FLOW Experiment zu erkennen. Diese Ergebnisse führten zur Annahme, dass Cand. Thiobios zoothamnicoli fähig ist, andere Ernährungsressourcen zu verwenden als Sulfid. Es wird angenommen, dass Cand. Endoriftia persephone fähig ist von Chemolithoautotrophie zu einer heterotrophen Lebensweise zu wechseln (Robidart et al. 2008). Wir nehmen an, dass auch Cand. Thiobios zoothamnicoli diese Fähigkeit besitzt, nicht zuletzt aus dem Wissen, dass alle autotrophen Organismen auch gewisse organische Substrate aufnehmen können und wohl Mixotrophie die Norm in der Natur ist (see Karl, 1995). Doch natürlich müssen metagenomische und funktionelle Untersuchungen unternommen werden, um herauszufinden, ob Cand. Thiobios zoothamnicoli einer heterotrophen Lebensweise befähigt ist.
Im Kontrast zu den Ergebnissen des FLOW und NO FLOW Experiments waren die erhaltenen Kolonien vom NONA Versuch aposymbiotisch. Dieses Ergebnis zeigt zum ersten Mal, dass es möglich ist, eine aposymbiotische Z. niveum Kolonie unter in vivo Bedingungen zu erhalten. Es wird angenommen, dass diese Kolonien keine Ektosymbionten mehr besitzen, weil im Gegensatz zu den bereits im Vorfeld ausgewachsenen Kolonien des FLOW und NO FLOW Experiments diese Kolonien unter ungünstigen Bedingungen heranwuchsen. Dabei könnte die Ektosymbiontenpopulation nicht nur durch folgende Faktoren dezimiert worden sein, welche auch für das FLOW und NO FLOW Experiment in Frage kommen: höhere Sterberate unter ungünstigen Bedingungen, das Verlassen des Wirtes oder das Abgeschiedenwerden vom Wirt. Beim heranwachsenden Wirten im NONA geschieht wahrscheinlich auch eine Verdünnung der Population, hervorgerufen durch die Zunahme an Wirtsoberfläche durch dessen Wachstum. Wie auch immer, durch welchen Mechanismus eine Cand. Thiobios zoothamnicoli Ektosymbiontenpopulation unter Ausschluss von Sulfid entweder dezimiert oder ganz ausgelöscht wird, ist in Frage gestellt. Weiters ist es von Interesse, ob eine aposymbiotische Kolonie fähig ist, ihren Lebenszyklus zu vollführen und ob aposymbiotische Kolonien wieder mit einem Ektosymbionten reinfiziert werden können. Man weiß nichts von einer freilebenden Cand. Thiobios zoothamnicoli Population. Wie wir sehen können, stehen noch viele Fragen in Bezug auf diese Symbiose offen. Die Tatsache aber, dass es möglich ist aposymbiotische Kolonien unter artifiziellen Bedingungen zu erzeugen, erweitert die Möglichkeiten an Experimenten, die durchgeführt werden können, um Antworten zu bekommen.
Abstract
(Englisch)
Before the discovery in 1981 of Riftia pachyptila living on deep sea hydrothermal vents, and containing a chemolithoautortrophic sulphur-oxidising symbiont, it was thought that only photoautotrophic and heterotrophic bacterial symbionts exist. This was the first description of a chemolithoautotrophic symbiont. After this discovery, there was an intense search for other chemolithotrophic symbiosis and this symbiosis is now known to exist in a broad range of habitats and for a broad range of host species. Bacteria capable of chemosynthesis occur in many different lineages, sulfur-oxidising bacteria, however, mainly belong to the Gammaproteobacteria. Knowledge on the mechanisms driving the interactions between the host and symbionts involved in chemolithoautotrophic symbiosis is still scarce. The symbiosis between the peritrich, feather-like Zoothamnium niveum and its sulphide-oxidising ectosymbiont Cand. Thiobios zoothamnicoli constitutes a promising, simple system with which to investigate research questions on functional aspects concerning cooperation and evolution, particularly for chemolithoautotrophic symbiosis. This system reproduces and grows rapidly, has a short lifetime and is the only thiotrophic symbiosis possible to cultivate over several generations.
Until now, one study has been undertaken on the behavior of this symbiosis under different experimental chemical conditions, focused mainly on the fitness of Z. niveum exposed to different sulphide concentrations. The morphology and fitness of Cand. Thiobios zoothamnicoli was also considered and those ectosymbionts treated under optimal culture conditions were compared to the in situ situation whereupon significant differences were noted (Rinke et al. 2007).
In the study presented here, in situ as well as in vivo specimens treated under optimal conditions were also analyzed. Furthermore, the fate of Cand. Thiobios zoothamnicoli was investigated under unfavorable conditions either for itself or for it´s host. It is known that the host's diet partly relies on free-living microbes from the surrounding water column (Rinke, 2002). However, it was still to be determined what happens if the host cannot access part of its diet through these free-living microbes. The response of Cand. Thiobios zoothamnicoli to a restriction of their host´s diet was also an open research question. Furthermore, the fate of Cand. Thiobios zoothamnicoli under a restriction in its usual nourishment - under sulphide starvation - was still to be investigated. Potential differences arising when this starvation occurs under water-flow or stagnant conditions as well as when Cand. Thiobios zoothamnicoli is attached to previously settled swarmers or adult Z. niveum colonies were also of interest.
These reearch questions were investigated by treating Zoothamnium niveum samples in vivo under optimal or suboptimal conditions either for 48 hours or for seven days. The in situ samples and those specimens used for in vivo treatments were collected in a canal next to a saline in Piran, Slovenia. The specimens treated under optimal in vivo conditions (OPNA) were raised from swarmers in a flow-through respirometer aquaria under sulphide supplementation in 32 µm filtered sea water for seven days. In a further approach, specimens were raised from swarmers in flow-through respirometer aquaria for seven days with sulphide supplementation and 0.2 µm filtered sea water (OPA), meaning that under these conditions the host could not feed on free-living microbes from the surrounding water column. To get an insight into what happens when Cand. Thiobios zoothamnicoli is kept under sulphide starvation, two approaches were followed: In the first approach, two sets of fully grown colonies with ectosymbionts attached were placed for 48 hours either in a respirometer flow-through aquarium with a flow rate of approximately 50 ml/h of 32 µm filtered sea water and no sulphide supplementation (FLOW) or in a embryo dish filled with 0.2 µm filtered sea water (NO FLOW). In the second approach, colonies were raised from swarmers in flow-through respirometer aquaria with a flow rate of approximately 50 ml/h of 32 µm filtered sea water and no sulphide supplementation for seven days (NONA).
Specimens were subsequently prepared for and scanned with a scanning electron microscope (SEM) and several parameters related to morphology and fitness of the symbionts covering the hosts feeding cells were evaluated and compared with each other and to results from literature. The feeding cells (microzooids) were divided into two parts to discern any differences between the ectosymbionts covering its upper (oral) and lower (aboral) part. The number of cells and the percentage of host surface coverage were determined in an 70 µm² frame positioned at the edge of the oral and the aboral part. The length and width of individual symbionts on both parts of the microzooid were also measured, with up to 70 cells independently examined in a clockwise helical pattern. From this data the volume and cell elongation index were calculated for the individual measured symbionts. Furthermore, the frequency of dividing cells (FDC) as a measure of fitness was measured in the same manner as cell length and width. The absolute number of dividing cells / 70 µm² as a measure of cell composition on the host surface was also calculated by combining the FDC with the number of cells measured per 70 µm².
The in situ and OPNA samples were compared with each other as well as with similar samples from literature (Rinke et al. 2007). From this it could be determined that Cand. Thiobios zoothamnicoli shows a response to the actual chemical conditions to which it is exposed. These findings support the classification of Cand. Thiobios zoothamnicoli as a pleomorphic cell-type (Bauer-Nebelsick et al. 1996a,b; Rinke et al. 2006). In addition, Cand. Thiobios zoothamnicoli was shown to undergo extreme morphological changes under sulphide starvation and it was supposed that this cell type is capable of forming bulging filaments.
To investigate what happens when the host is restricted in its access to free-living microbes, the samples treated under OPNA and OPA conditions were compared. The host treated under OPA conditions was seen to have half the proliferation rate and therefore half the size of the host treated under OPNA conditions. Although sulphide was available in both treatments and both symbiont populations were seen to have an equal proliferation rate, the smaller hosts were not overgrown by the symbionts. It is suspected that the homeostasis between the two partners of this symbiosis is controlled by the host, as supported by other examples of symbiosis in literature (see Douglas, 2010; Brooks & Richards, 1955; Ruby & Asato, 1993; Whitehead & Douglas, 1993).
When Cand. Thiobios zoothamnicoli was attached to fully grown colonies and kept under sulphide starvation in the FLOW and NO FLOW treatment, the symbiosis was still maintained after 48 hours. Although the number of ectosymbionts significantly decreased under both conditions, the remaining ectosymbionts were seen to still undergo division and had an enlarged size. These findings led to the conclusion that Cand. Thiobios zoothamnicoli is capable of utilizing nutritional sources other than sulphide.
However, the resulting colonies from the NONA treatment were no longer covered by ectosymbionts. This represented the first time aposymbiotic Z. niveum colonies have been established under artificial conditions. The fate of the ectosymbionts under these conditions is still to be investigated.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
bacteria protist symbiosis sulphide thiotrophic symbiosis Cand. Thiobios zoothamnicoli Zoothamnium niveum
Schlagwörter
(Deutsch)
Bakterien Protist Symbiose Sulfid Thiotrophe Symbiose Cand. Thiobios zoothamnicoli Zoothamnium niveum
Autor*innen
Judith Drexel
Haupttitel (Englisch)
Morphology and fitness of the thiotrophic symbiont Cand. Thiobios zoothamnicoli in situ and in vivo
Paralleltitel (Deutsch)
Morphologie und Fitness des thiotrophen Symbionten Cand. Thiobios zoothamnicoli in situ und in vivo
Paralleltitel (Englisch)
Morphology and Fitness of the thiotrophic Symbiont Cand. Thiobios zoothamnicoli in situ and in vivo
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
IX, 66 S. : Ill., graf. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Monika Bright
AC Nummer
AC11603952
Utheses ID
27163
Studienkennzahl
UA | 444 | | |