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Determination of the DNA Methylation Status of Breast Cancer-Related Genes in Vivo and in Vitro by High Resolution Melting Analysis
Elisabeth Holzweber
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.30480
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29109.45505.414864-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen und daher ist es von großem Interesse, Biomarker für die Früherkennung zu entwickeln. Neben genetischen Veränderungen wurden auch epigenetische Modifikationen, insbesondere die DNA-Methylierung, als wichtige Faktoren bei der Entstehung von Brustkrebs identifiziert. Eine DNA-Methylierung ist bei Menschen und anderen Säugetieren fast ausschließlich an der 5-Position von Cytosinen in CpG-Dinukleotiden zu finden und ist ein frühes Ereignis in der Karzinogenese. Diverse Studien haben gezeigt, dass eine Hypermethylierung in der Promotorregion von Genen zu einer verminderten Genexpression führen kann – im Falle von Tumorsuppressorgenen kann dies zu erhöhtem Krebsrisiko beitragen.
Im Rahmen der Masterarbeit wurde der DNA-Methylierungsgrad in vivo und in vitro mittels Methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) bestimmt. Dafür wurde im Vorfeld eine MS-HRM Methode für das Brustkrebs-relevante Gen CCND2 entwickelt und optimiert. Die praktische Laborarbeit bestand aus DNA-Extraktion, Bisulfit-Konvertierung von Proben-DNA und menschlicher Kontroll-DNA, Amplifikation der Zielsequenz mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) und HRM Analyse.
Der Schwerpunkt lag auf der Untersuchung des DNA-Methylierungsgrades in der Promotorregion verschiedener Tumorsuppressorgene (APC, BRCA1, CCND2, CDKN2A, GSTP1 und RASSF1A) von Brustkrebspatientinnen. Für diesen Zweck wurden je drei Biopsieproben von fünfzehn Patientinnen mit Mammakarzinom (Tumor, tumornahes und tumorfernes Gewebe) von Ass. Prof. Dr. Georg Pfeiler, Medizinische Universität Wien, entnommen und mittels MS-HRM Analyse wurde der Methylierungsgrad bestimmt. Es konnten beträchtliche Unterschiede im DNA-Methylierungsstatus zwischen den verschiedenen Gewebearten gefunden werden, wobei in den Genen RASSF1A und APC bei etwa 60% der Patientinnen ein signifikanter Unterschied zwischen Tumorgewebe und tumornahem bzw. tumorfernem Gewebe beobachtet wurde. Weiters wurden bei den Tumorgeweben zwischen den Patientinnen große Unterschiede im DNA-Methylierungsgrad bei den einzelnen Genen festgestellt. Beispielsweise zeigten zwei Brustkrebspatientinnen in der Promotorregion der Gene BRCA1 und CDKN2A eine Hypermethylierung von über 50%, wohingegen die übrigen Patientinnen keine quantifizierbare Methylierung aufwiesen. Außerdem war der DNA-Methylierungsstatus der Tumorgewebe zwischen den Genen sehr unterschiedlich. Während bei APC bei der Hälfte der Tumorproben eine Hypermethylierung von über 50% beobachtet wurde, war der höchste Wert bei CCND2 lediglich 17%. Bei GSTP1 wurde bei den Tumorproben keine Hypermethylierung festgestellt.
Eine weitere Aufgabenstellung umfasste Inkubationsexperimente an der Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 mit Nahrungsergänzungsmitteln (Propolis und Tomatenextrakt), wobei die Präparate in unterschiedlichen Konzentrationen getestet wurden. Erste Analysen zeigten keine Änderungen im DNA-Methylierungsgrad in der Promotorregion von CCND2 als Folge der Inkubation mit Propolis. Im 3. Exon von CDKN2A wurde eine geringe Erhöhung des Methylierungsgrades als Folge der Inkubation mit Propolis festgestellt. Erste Analysen lassen darauf schließen, dass der Tomatenextrakt keinen Einfluss auf den Methylierungsgrad hat.
Abstract
(Englisch)
Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer in women and therefore there is a great interest in developing biomarkers for its early detection. In addition to genetic changes also epigenetic modifications, particularly DNA methylation, have been identified in association with the development of breast cancer. DNA methylation is found in humans and other mammals almost exclusively at the C5 position of cytosines in CpG dinucleotides and is an early event in carcinogenesis. Several studies have shown that hypermethylation of the promoter region of genes can lead to a reduced expression and in the case of tumor suppressor genes may contribute to increased risk of cancer.
Within the framework of this master thesis, the DNA methylation status was determined in vivo and in vitro using methylation sensitive high resolution melting analysis (MS-HRM). Therefore, an MS-HRM method for the breast cancer-related gene CCND2 was designed and optimized. Practical laboratory work consisted of DNA extraction, bisulfite conversion of sample DNA and human control standards, amplification of target sequence by polymerase chain reaction (PCR) and HRM analysis.
The focus of the present work was the investigation of the DNA methylation status in the promoter region of various tumor suppressor genes (APC, BRCA1, CCND2, CDKN2A, GSTP1 and RASSF1A) of breast cancer patients. Breast samples (tumor, adjacent and normal tissue) from fifteen breast cancer patients were biopsied by Ass. Prof. Dr. Georg Pfeiler, Medical University of Vienna, and the DNA methylation status was determined using MS-HRM analysis. Significant differences in the DNA methylation status between the tissue types could be found, in which APC and RASSF1A showed the highest differences between tumor and adjacent/normal breast tissues. Furthermore, in the tumor tissues great differences between patients related to the same genes were observed. For example, two breast cancer patients showed hypermethylation of about 50% in the promoter region of BRCA1 and CDKN2A, whereas the other patients had no methylation. In addition, the DNA methylation status of the tumor tissues was very different between the genes. While APC was methylated over 50% in half of the tumor samples, the highest value in CCND2 was only 17%. In none of the tissue samples, GSTP1 was methylated above the LOQ.
Another task was the incubation of MCF-7 breast cancer cells with supplements (propolis and tomato extract). Preliminary experiments did not show any changes in DNA methylation in the promoter region of CCND2 by incubation with propolis. In exon 3 of CDKN2A a low increase in the DNA methylation status was found by incubation with propolis, whereas first analyses indicate that the tomato extract does not influence the methylation status.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Epigenetic DNA Methylation High Hesolution Melting (HRM) Analysis MCF-7 Cell Line Biopsy Samples
Schlagwörter
(Deutsch)
Epigenetik DNA Methylierung hochauflösende Schmelzkurvenanalyse MCF-7 Zelllinie Biopsieproben
Autor*innen
Elisabeth Holzweber
Haupttitel (Englisch)
Determination of the DNA Methylation Status of Breast Cancer-Related Genes in Vivo and in Vitro by High Resolution Melting Analysis
Paralleltitel (Deutsch)
Bestimmung des DNA Methylierungsgrades von Brustkrebs-relevanten Genen in vivo und in vitro mittels hochauflösender Schmelzkurvenanalyse
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
123 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikation
35 Chemie > 35.39 Analytische Chemie: Sonstiges
AC Nummer
AC11819015
Utheses ID
27165
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |