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Dissecting small RNA silencing pathways in mouse embryonic stem cells
Fabian Braukmann
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Stefan Ameres
DOI
10.25365/thesis.30504
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29950.28098.869766-5
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
MicroRNAs (miRNAs) regulieren Genexpression auf der post-transkriptionalen Ebene und garantieren reguläre Entwicklung und Physiologie. Genetische Screening-Studien im Fadenwurm und der Fruchtfliege haben zu dem Verständnis des kleinen RNA Genregulationsweg in Säugetieren beigetragen. Die jüngste Entwicklung von haploiden maus-embryonalen Stammzellen (mESCs) ermöglicht uns die genetischen Anforderungen dieses Genregulationswegs direkt in Mäusen zu bestimmen. Die Möglichkeit, Mutanten des kleinen RNA Genregulationsweg in einer Screening-Studie zu generieren wird durch die Charakterisierung einer exemplarischen mESC-Linie überprüft. Diese entstand in einer zufällig screening Studie, in welcher ein retrovirales Konstrukt zufällig eine verbesserte Genfalle innerhalb des Drosha Gens integrierte (Drosha-mutierte mESCs) wurde. Des Weiteren testete ich Reporterkonstrukte um eine selektive screening-Studie für die genetischen Anforderungen in mECS zu ermöglichen.
Die Analyse von Drosha-mutierten mESCs zeigt, dass die Mutagenese-Methode sowohl Droshas mRNA- und Proteinkonzentration als auch die Konzentration von kanonische miRNAs verringert. Zusätzlich konnte die gegenseitige Regulation von Drosha und DGCR8 rekapituliert werden. Die systematische Analyse zweier Konstrukte, welche die Generegulation von kleinen RNAs offenbarten, ermöglicht die Entwicklung von verbesserten screening Strategien in mESC.
Diese Resultate zeigen, dass haploide mESCs und die verbesserte Genfalle die Identifikation und Charakterisierung von Mutanten des kleinen RNA Genregulationsweg ermöglichen und die generierten Mutanten molekulare und biologische Funktionen rekapitulieren. Außerdem schlagen wir eine Möglichkeit vor, um eine selektive screening Studie für Komponenten des kleinen RNA Genregulationsweg durchzuführen.
Abstract
(Englisch)
MicroRNAs (miRNAs) regulate the expression of genes at the post-transcriptional level, ensuring normal development and physiology. Much of what is known about the genetic composition of small RNA pathways in mammals is inferred from genetic screens performed in model organisms, such as flies and worms. The recent generation of haploid mouse embryonic stem-cells (mESCs) enables us to directly address the genetic requirements for murine small RNA pathways. As a proof-of-principle for such a screen, we initially characterize a mESC line bearing an enhanced gene-trap insertion in the Drosha gene, fortuitously isolated from random retroviral mutagenesis of haploid mESCs.
The analysis of the Drosha mutant mESCs revealed changes in Drosha gene products and miRNA profile. The mutagenesis approach results in a ~100 fold decrease in drosha mRNA levels, rendering the protein undetectable in Western blot analysis. Moreover Drosha mutant mESCs recapitulate post-transcriptional cross-regulation between Drosha and its double-stranded RNA binding partner DGCR8, resulting in elevated dgcr8 mRNA levels; and the global decrease in small RNA levels affects Argonaute 2 protein stability, while mRNA levels are increased. The systematic analysis of constructs reporting either on endogenous or artificial small RNA-mediated gene regulation in Drosha mutant mESCs evaluates different strategies to establish a screening system for the genetic requirements of small RNA-mediated gene regulation in mESCs.
Together, our results show that haploid mESCs combined with enhanced gene-trap mutagenesis allows identifying and characterizing core components of the miRNA pathway in a genetic screen. The generated mutants validate important molecular and biological functions of small RNA-mediated gene silencing. Finally, we propose strategies for the systematic identification of novel miRNA pathway components in a genetic screen.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
microRNA
Schlagwörter
(Deutsch)
microRNA
Autor*innen
Fabian Braukmann
Haupttitel (Englisch)
Dissecting small RNA silencing pathways in mouse embryonic stem cells
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse des kleien RNA Genregulationsweg in Maus embrynoischen Stammzellen
Paralleltitel (Englisch)
Dissecting small RNA silencing pathways in mouse embryonic stem cells
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
82 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Stefan Ameres
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11818957
Utheses ID
27183
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |