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Studying the siderocalin NGAL and selective isotope labelling of GB1 by NMR
Katharina Weinhäupl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Robert Konrat
DOI
10.25365/thesis.30865
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29585.08708.706459-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das 25 kDa Protein NGAL gehört zu den Siderocalinen, einer Untergruppe der vielfältigen Lipocalin-Proteinfamilie, die Eisen über Siderophore bindet. Diese Fähigkeit ist eine Voraussetzung für die Vielzahl an physiologischen Funktionen von NGAL. Diese reichen von antibakterieller Abwehr und Reg- ulierung des Eisenstoffwechsels bis zu Differenzierung, Assoziierung mit Ent- zündungsprozessen und Tumorprogression. Ein wichtiger Partner in seiner Funktion ist sein zellulärer Rezeptor 24p3R, der für die Endozytose des NGAL-Rezeptor Komplexes verantwortlich ist.50
Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der Wechselwirkung von NGAL mit seinem Rezeptor 24p3R. Zwei Neben- projekte befassen sich mit der Suche nach neuen Liganden für NGAL und der Entwicklung neuer selektiver Markierungs Techniken für die Aminosäuren Valin, Tyrosin und Phenylalanin.
Die Bindung von NGAL an die N-terminale Domäne (NTD) von 24p3R resultiert in starker Peakverbreiterung der betroffenen Aminosäurereste im NMR-Spektrum, daher war die Anwendung von CPMG Experimenten, einer NMR-Methode, um niedrig besetzte oder angeregte Zuständen zu unter- suchen, erforderlich. Mittels 1H-15N HSQC entdeckten wir drei verschiedene Regionen in der NTD, die unterschiedlich durch die Bindung an NGAL bee- influsst werden. Dieses Verhalten wird auch in den jeweiligen Relaxations- Dispersions Kurven widergespiegelt. Um mehr Informationen über den gebun- denen Zustand zu erhalten, haben wir MTSL und LBP als paramagnetis- che Tags in NGAL eingeführt um PRE-, PCS- und RDC-Messungen zu er- möglichen.
Zusätzlich ermittelten wir vier neue fluorierte Liganden von NGAL, die als Ausgangspunkte für einen FBDD Ansatz verwendet werden könnten. Unter Berücksichtigung der physiologischen und pathophysiologischen Be- deutung von NGAL, stellt die Suche nach neuen Liganden ein interessantes Forschungsgebiet dar.
Darüber hinaus haben wir erfolgreich drei neue selektive Markierungs Strategien für das Modellprotein GB1 entwickelt. Selektive Markierung der Seitenkette von Valin wurde mit den Ausgangsstoffen 2-Ketoisocaproat und 2-Ketoisovalerat erreicht. Während p-Hydroxy-α-ketophenylpyruvat und α- ketophenylpyruvat als Ausgangsstoffe für die selektive Markierung der Car- bonyle von Tyrosinen und Phenylalaninen des Proteinrückgrats dienten.
Zusammenfassend haben wir die Wechselwirkung von NGAL und seinem zellulären Rezeptor 24p3R, einem interessanten System der antibakteriellen Immunabwehr und des Eisenstoffwechsels, untersucht. Außerdem konnten wir vier neue Liganden für NGAL entdecken und drei neue selektive Markierungs Strategien für Valine, Tyrosine und Phenylalanine anwenden.
Abstract
(Englisch)
The 25 kDa protein NGAL is a siderocalin, a subgroup of the diverse lipocalin protein family, that chelates iron via siderophores. This ability is a prerequi- site for the multitude of physiological functions of NGAL. These range from antibacterial defence and regulation of the iron metabolism to differentia- tion, association with inflammation and cancer progression. An important partner in its function is its cellular receptor 24p3R that is responsible for the endocytosis of the NGAL-receptor complex.50
The main part of this work deals with characterizing the interaction of NGAL with its receptor 24p3R. Two side projects are concerned with the finding of new ligands for NGAL and the development of new selective la- belling techniques for the amino acids valine, tyrosine and phenylalanine.
Binding of NGAL to the N-terminal domain (NTD) of 24p3R results in severe peak broadening of the affected residues in the NMR spectrum, thus requiring the application of CPMG experiments, a NMR method to study low populated or excited states. Using 1H-15N HSQC we detected three distinct regions in the NTD, that are differently affected by binding to NGAL. This behaviour is also reflected in the respective relaxation dispersion curves. To obtain more information about the bound state we introduced MTSL and a lanthanide binding peptide as paramagnetic tags into NGAL to enable PRE, PCS and RDC measurements.
Additionally we identified four new fluorinated ligands for NGAL, that can be used as starting points for a FBDD approach. Considering the phys- iological and pathophysiological importance of NGAL, the search for new ligands poses an interesting research topic.
Moreover, we successfully employed three new selective labelling strate- gies on the model protein GB1. Selective sidechain labelling of valines was achieved using the precursors 2-ketoisocaproate and 2-ketoisovalerate. While p-hydroxy-α-ketophenylpyruvate and α-ketophenylpyruvate served as precur- sors for the selective labelling of tyrosine and phenylalanine backbone car- bonyls respectively.
In summary, we investigated the interaction of NGAL and its cellular receptor 24p3R, an interesting system for antibacterial host defence and iron metabolism. Furthermore we were able to discover four new ligands for NGAL and applied three new selective labelling strategies for valines, pheny- lalanines and tyrosines.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
NGAL 24p3R selective labelling of amino acids fluorinated ligands NMR
Schlagwörter
(Deutsch)
NGAL 24p3R Selektive Markierung von Aminosäuren Fluorierte Liganden NMR
Autor*innen
Katharina Weinhäupl
Haupttitel (Englisch)
Studying the siderocalin NGAL and selective isotope labelling of GB1 by NMR
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung des Siderocalins NGAL und Selektive Isotopen Markierung von GB1 mit NMR
Paralleltitel (Englisch)
Studying the Siderocalin NGAL and Selective Isotope Labelling of GB1 by NMR
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
104 S. : Ill.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Konrat
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11830611
Utheses ID
27473
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |