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Structure and assembly mechanism of TbBILBO1, an essential flagellar pocket collar protein

Keni Vidilaseris

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Zentrum für Molekulare Biologie

Betreuer*in

Gang Dong

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DOI

10.25365/thesis.31072

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29468.71883.284962-4

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der von der Tsetse Fliege übertragen wird und die Schlafkrankheit in Afrika verursacht. T. Brucei hat ein einzelnes Flagellum, das nahe dem hinteren Ende der Zelle herausragt. Dieses Flagellum ist von Bedeutung für die Beweglichkeit des Parasiten und für seine Anhaftung an das Epithelium der Speicheldrüse der Tsetse Fliege. An der Basis der Geißel befindet sich eine einzigartige Organelle, genannt Flagellar Pocket (FP). FP ist der einzige Ort für alle Vorgänge der Endo- und Exozytose und spielt eine entscheidende Rolle in der Verteidigung der Zelle gegen das Immunsystem des Wirts. Am oberen Ansatz der FP befindet sich ein Element der zytoskelettalen Barriere, die sogenannte Flagellar Pocket Collar (FPC). T. brucei BILBO (TbBILBO1) war die erste charakterisierte Komponente von FPC. Dieses Protein ist in hohen Maße unter Trypanosomatiden konserviert und ist sowohl für die FP Biogenese als auch für die Lebensfähigkeit der Parasiten essentiel. In dieser Studie wird die strukturelle Charakterisation des 67-kDa Proteins TbBILBO1 beschrieben. Basierend auf der Vorhersage der Sekundärstruktur besteht TbBILBO1 aus einer kugelförmigen N- terminalen Domäne (NTD, aa 1-110), zwei EF-Hand Motiven (EFh, aa 183-249), und einer zentralen coiled-coil Domäne (CCD, aa 263 -533), gefolgt von einem C-terminalen Leucin-Zipper (LZ, aa 534-578). Meine Lokalisierungsanalysen in der prozyklischen Form von T. brucei zeigten, dass der LZ von wesentlicher Bedeutung für die genaue Ausrichtung von TbBILBO1 an der FPC ist. Die Überexpression einer TbBILBO1 Mutante, bei der die NTD fehlte (TbBILBO1-ΔNTD), wirkte sich 4 Tage nach der Induktion lethal auf die Zellen aus, nicht dagegen die Überexpression des kompletten Proteins (TbBILBO1-FL). NMR-und Röntgenstrukturanalysen von TbBILBO1 - NTD zeigten, dass es eine Ubiquitin - ähnliche Faltung mit einer konservierten aromatisch/basischen Stelle an der Oberflächen annahm, die kritisch für die TbBILBO1 Funktion in vivo war und ein potenzielles Ziel für therapeutische Medikamente darstellt. Diese Stelle interagierte auch mit der C- terminalen Domäne von FPC4, eine weitere, neulich identifizierte Komponente von FPC. Weiters wird beschrieben, dass das komplette TbBILBO1 eine filament ähnliche Struktur sowohl durch die antiparallele Anordnung der zentrale Coiled-Coil Domain als auch durch die LZ -vermittelte inter - Dimer Interaktion bildete. Diese Struktur wurde dann in verkürzten Fasern über seitliche Assoziation zwischen den Filamenten aufgebaut. Zusammengefasst zeigten meine Daten, dass TbBILBO1 die Eigenschaften besitzt, um eine Membran-gebundene manschetten-ähnliche Struktur zu bilden und dass das Auftreten von EFh wesentlich für die Steuerung der Gating-Funktion des FPC ist.

Abstract

(Englisch)

Trypanosoma brucei is a unicellular parasite transmitted by tsetse flies that causes sleeping sickness in Africa. T. brucei has a single flagellum that emerges near the posterior end of the cell. The flagellum is important for the parasite's motility and attachment to the tsetse fly salivary gland epithelium. At the base of the flagellum is a unique organelle termed the flagellar pocket (FP). The FP is the sole site for all endo- and exocytosis and plays crucial roles in the cell’s defense against the host immune system. At the neck region of the FP is a cytoskeletal barrier element termed the flagellar pocket collar (FPC). T. brucei BILBO1 (TbBILBO1) was the first characterized component of the FPC. This protein is highly conserved among trypanosomatids and essential for both FP biogenesis and the viability of the parasite. Here, I report structural characterizations of the 67-kDa TbBILBO1. Based on secondary structure predictions, TbBILBO1 consists of a globular N-terminal domain (NTD, residues 1-110), two EF-hand motifs (EFh, residues 183-249), and a central coiled-coil domain (CCD, residues 263-533) followed by a C-terminal leucine zipper (LZ, residues 534-578). My localization analysis in the procyclic form of T. brucei showed that the LZ is essential for targeting of TbBILBO1 to the FPC. Overexpression of TbBILBO1-ΔNTD (a construct lacking the NTD), but not the full-length TbBILBO1, was lethal after 4 days of induction. The NMR and X-ray structures of the TbBILBO1-NTD revealed that it adopts a ubiquitin-like fold with a conserved aromatic/basic surface patch that is critical for TbBILBO1 function in vivo, implying that it is a potential target for therapeutic drugs. This patch also interacted with the C-terminal domain of FPC4, another newly identified FPC component. I also demonstrated that full-length TbBILBO1 forms a filament-like structure via both the antiparallel arrangement of the central coiled-coil and the LZ-mediated inter-dimer interaction. This structure seems to further assemble into condensed fibers via lateral association between the filaments. Taken together, these data suggest that TbBILBO1 has the properties needed to form a collar structure and the with EFh being potentially essential to control the gating function of the FPC.

Autor*innen

Keni Vidilaseris

Haupttitel (Englisch)

Structure and assembly mechanism of TbBILBO1, an essential flagellar pocket collar protein

Paralleltitel (Deutsch)

Struktur und Aufbaumechanismus von TbBILBO1, einem essentiellen Protein des Flagellar Pocket Collar

Publikationsjahr

2014

Umfangsangabe

165 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Tim Skern ,

Karin Reinisch

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC11872590

Utheses ID

27644

Studienkennzahl

UA | 094 | 490 | |

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Schlagwörter