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Analysis of Tle genes in medaka embryonic development
Gerlinde Jung
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Erwin Heberle-Bors
DOI
10.25365/thesis.31428
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29519.98273.976653-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
„Groucho/Transducin-like enhancer of split“ (Gro/TLE) Proteine gehören zu einer konservierten Familie von Korepressoren. Durch die Interaktion mit DNA gebundenen Proteinen hemmen sie die Transkription auf mehrere verschiedene Arten. Dadurch hat Gro/TLE eine Schlüsselrolle in verschiedensten entwicklungsbiologischen Prozessen, aber auch in der Entstehung von Krankheiten. Der Hauptteil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Rolle von Gro/TLE in der frühen embryonalen Entwicklung von Medakafischen. Für diese Analyse wurde die Funktion durch ihren Antagonisten, “Amino-terminal Enhancer of Split“ (Aes) in einer Hitze induzierbaren transgenen Fischlinie gehemmt. Die Embryonen entwickelten kleinere Augen, deren anteriores Ende nach medial kippte, wo es zu einem zyklopischen Auge zusammen wuchs. In schweren Fällen wurde die Augenentwicklung zur Gänze gehemmt. „Knock-down“ von einzelnen Mitgliedern dieser großen Genfamilie bestätigten die Ergebnisse.
Tcf3 ist einer der Interaktionspartner von Gro/TLE dem eine wichtige Rolle in der anterio-posterior Entwicklung zugeschrieben wird. Zebrafischembryonen ohne Tcf3 entwickelten keine Augen. Eine Expressionsanalyse des einzigen Medaka tcf3 Gens zeigte ähnliche Muster wie eine Kombination der zwei Zebrafisch Orthologe headless und tcf3. Embryonen, deren tcf3 Funktion durch PNA Moleküle oder Morpholino Oligonucleotide ausgeschaltet wurde, entwickelten kleine oder gar keine Augen. Zusätzlich war das Expressionsmuster der molekularen Marker pax2, pax6 und gbx1 anterior verschoben. Auch diese Beobachtungen waren vergleichbar mit Zebrafisch Resultaten. Die Überexpressionsphänotypen ähnelten wiederum denen der Aes-induzierten Embryonen. Injektionen mit tcf3 Versionen, deren Gro/TLE Interaktionsdomäne fehlte, zeigten eine deutlich reduzierte Zahl an Phänotypen, ein weiteres Indiz dafür, dass Gro/TLE eine Rolle in diesem Prozess spielt.
Oft werden Antisensemoleküle für die Inaktivierung von Genen in Fischen verwendet. Sie werden mittels Mikroinjektion in den Embryo appliziert. Variierende Ergebnisse dieser Methode machen Alternativen mit höherer Reproduzierbarkeit interessant. Medakaembryonen reagieren weniger empfindlich auf Chemikalien (z.B. Litiumchlorid) als Zebrafische. Eine Erklärung dafür ist, dass die Embryonen durch eine starre Außenhülle, dem sogenannten Chorion, geschützt werden. Genauere Analysen des Chorions zeigten, dass große Moleküle diese Barriere wirklich nicht passieren konnten, kleine jedoch ungehindert bis in den Perivitellinraum vordringen konnten. Das Entfernen des Chorions brachte nur wenig Verbesserung. Es scheint deshalb, dass nicht, wie bisher angenommen, die harte Außenhülle, sondern ein weiteres Membransystem im Inneren des Embryos der Ausschlussgrund für viele Moleküle ist. Die Zugabe von Detergentien verbesserte die Durchlässigkeit wesentlich, hatte jedoch auch Auswirkungen auf die interne Verteilung der jeweiligen Chemikalien. Elektroporation dagegen steigerte nur deren Aufnahme, ohne ihre Verteilungseigenschaften zu ändern und stellt damit eine effiziente Methode für die Aufnahme kleiner Moleküle in Medaka Embryonen dar.
Abstract
(Englisch)
Groucho/Transducine-like Enhancers of Split (Gro/TLE) belong to a conserved protein family of co-repressors. They mediate repression through interaction with various DNA-binding proteins by multiple molecular mechanisms, making them important players during developmental processes and in several diseases. The main part of this thesis focuses on their role in the embryonic development of medaka. For this, the function of Gro/TLE proteins was impaired by misexpressing their antagonist Amino-terminal Enhancer of Split (Aes) in heat shock inducible transgenic lines. The embryos developed smaller eyes that were tilted towards the midline where they fused to a cyclopic eye or were even lost in severe cases. To confirm these results individual members of this multigene family were knocked down. As expected, eye phenotypes like cyclopia appeared confirming the results of the misexpression experiments.
Tcf3 is an interaction partner of Gro/TLE and an important determinant of anterior-posterior development. In zebrafish, lack of tcf3 function resulted in eye-less embryos. zThe single medaka tcf3 gene is expressed in a pattern comparable to its zebrafish orthologous headless and tcf3b. Loss of function experiments with PNA and morpholino antisense molecules resulted in anophthalmia and showed an anterior shift of the expression markers pax2, pax6 and gbx1. These results are in good agreement with zebrafish data. The phenotypes of gain of function experiments resembled those of aes-induced embryos. However, injection of tcf3 versions lacking the Gro/TLE interaction domain showed strongly reduced eye phenotypes, indicating a role of Gro/TLE corepressors in this process.
The application of antisense molecules is an efficient way of gene inactivation in fish. Since microinjection generates varying results, methods with better reproducibility were explored. Compared to zebrafish, medaka have a substantially reduced sensitivity for chemicals (e.g. lithium chloride) and it is commonly assumed that this is due to the rigid chorion surrounding the embryo. Indeed, closer inspection of the chorion showed that larger molecules were not able to cross the chorionic barrier whereas small fluorescing tracer molecules readily passed into the perivitellin space. Interestingly, dechorionation only slightly improved the uptake into the embryos; instead inner membranes were identified as the limiting structure for diffusion. Adding detergents improved the diffusion effectively but also affected the internal distribution of the chemicals. Finally, electroporation could be established as a suitable method to enhance the uptake of small molecules into medaka embryos.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
Medaka Tle Tcf3 Developmental Biology Electroporation
Schlagwörter
(Deutsch)
Medaka Tle Tcf3 Entwicklungsbiologie Elektroporation
Autor*innen
Gerlinde Jung
Haupttitel (Englisch)
Analysis of Tle genes in medaka embryonic development
Paralleltitel (Deutsch)
Analyse von Tle Genen in der Embryonalentwicklung von Medaka
Publikationsjahr
2013
Umfangsangabe
194 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Kirstin Tessmar-Raible ,
Berta Alsina
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC11998236
Utheses ID
27944
Studienkennzahl
UA | 091 | 490 | |